הפקת ויריונים זיהומיים מתאים שעברו טרנספקציה של RNA סינתטי המופק מכרומוזום מלאכותי בקטריאלי (BAC)

תקציר

מקור: יוון, ס'. ועמיתיהםכרומוזומים מלאכותיים חיידקיים: כלי גנומיקה פונקציונלית לחקר וירוסי RNA בעלי גדיל חיובי. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים את השחזור של נגיף דלקת המוח היפנית (Japanese encephalitis virus) זיהומי מ-RNA סינתטי שהועתק משכפול של כרומוזום מלאכותי בקטריאלי. הוא מראה כיצד תאים עוברים אלקטרופורציה עם ה-RNA הסינתטי, מה שמאפשר לגנום הנגיפי להנחות את ייצורם של ויריונים חדשים. הפלאקים שנוצרו בשכבות התאים המอดูהים מאשרים את השחזור המוצלח של נגיף זיהומי.

פרוטוקול

1. קביעת זיהומיות ה-RNA ותוצר הנגיף

1. גדלו תאי כליה של חולדה צעירה-21 (BHK-21) בצלחות תרבית של 150 mm בצפיפות של 3 × 10⁶ cells/dish למשך 24 hr ב-37 °C עם 5% CO₂.
   הערה: תחזיקו את תאי ה-BHK-21 במצע alpha minimum essential המועשר ב-10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine, ויטמינים ו-penicillin/streptomycin.
2. שטפו את השכבה התאית (monolayer) עם 10 ml של Solution A קר (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na₂HPO₄, ו-1.5 mM KH₂PO₄). נתקו את התאים מהצלחות על ידי טיפול ב-4 ml של trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (0.25%), ואספו אותם על ידי סבב צנטריפוגה ב-270 × g בצנטריפוגת שולחן למשך 2 min.
3. השביו את משקע התאים (cell pellet) ב-50 ml של Solution A קר במבחנה קונית של 50 ml וסובבו את תרחיף התאים ב-270 × g למשך 2 min. חזרו על הליך שטיפה זה שלוש פעמים; לאחר השטיפה האחרונה, השביו את משקע התאים בצפיפות של 2 × 10⁷ cells/ml ב-Solution A.
4. ערבבו מנה (aliquot) של 400 µl מתרחיף התאים עם 2 µg של RNA סינתטי בקוובטה עם מרווח של 2-mm, ובצעו מיד אלקטרופורציה לתערובת באמצעות אלקטרופורטור תחת תנאי אלקטרופורציה אופטימליים: 980 V, אורך פולס של 99 µsec, ו-5 פולסים (איור 1C).
5. השאירו את התאים שעברו אלקטרופורציה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 min והעבירו אותם למיקרו-מבחנה של 1.7 ml המכילה 600 µl של מצע תרבית מלא.
6. הכינו דילול סדרתי פי 10 של התאים שעברו אלקטרופורציה ב-1 ml של מצע תרבית מלא, וזרוו מנה של 100 µl מכל דילול על שכבות תאי BHK-21 שלא עברו אלקטרופורציה (5 × 10⁵) בצלחת 6-בארים.
7. לאחר 4-6 hr של אינקובציה, כסו את התאים ב-0.5% agarose במצע minimal essential המכיל 10% fetal bovine serum. דגרו את הצלחות למשך 4 ימים ב-37 °C עם 5% CO₂.
8. דמיינו את המוקדים הזיהומיים (plaque) על ידי קיבוע ב-7% formaldehyde וצביעה ב-1% crystal violet ב-5% ethanol (איור 2A).
   1. אופציונלי: בחנו תאים שעברו אלקטרופורציה של RNA ב-18-20 hr לאחר הטרנספקציה לאקספרסיה של חלבוני נגיף דלקת המוח היפנית (JEV) באמצעות בדיקות אימונופלואורסצנציה (איור 2B), ואספו את העל-נוזלים (supernatants) מהתאים שעברו אלקטרופורציה של RNA ב-22 ו-40 hr לאחר הטרנספקציה לצורך טיטרציה של הנגיף באמצעות בדיקות פלאק (איור 2C).

תוצאות

איור 1. סקירה כללית של התאוששות נגיפים זיהומיים מ-cDNA (complementary DNA) מלא של JEV SA₁₄-14-2 שהורכב בתוך כרומוזום מלאכותי חיידקי (BAC). (A) ליניאריזציה של תבנית ה-cDNA. ה-JEV BAC המלא נחתך על ידי XbaI ומטופל בנוקלאזאז פולי פולי (mung bean nuclease - MBN). (B) סינתזה של תמלילי ה-RNA. ה-cDNA הליניארי מותמל על ידי SP6 RNA polymerase בנוכחות m⁷G(5')ppp(5')A cap analog. (C) התאוששות של נגיפי JEV סינתטיים. ה-RNAs שותמלו in vitro מועברים לתאי BHK-21 באמצעות אלקטרופורציה, תהליך היוצר תיתר גבוה של נגיף סינתטי.

איור 2. זיהומיות ספציפית של RNA סינתטי שהועתק מ-BAC של JEV באורך מלא ושחזור של נגיף סינתטי. תאי BHK-21 עברו אלקטרופורציה דמה (Mock) או אלקטרופורציה עם תמלילי RNA שהופקו מכל אחד משני השיבטים העצמאיים של ה-BAC של JEV באורך מלא (Cl.1 ו-Cl.2). (A) זיהומיות RNA. התאים כוסו באגרוז ונצבעו ב-crystal violet ארבעה ימים לאחר הטרנספקציה. זיהומיות ה-RNA נקבעה באמצעות בדיקות מרכזים זיהומיים כדי להעריך את כמות ה-RNA הזיהומי שעבר אלקטרופורציה לתאים (פאנל שמאלי). כמו כן, מוצגות תמונות נציגות של מרכזים זיהומיים (פאנל ימני). (B) ביטוי חלבון. התאים גודלו בlamellae עם 4 תאים. ביטוי חלבון נגיפי בתאים שעברו אלקטרופורציית RNA ב-20 שעות לאחר הטרנספקציה (hpt) נותח באמצעות בדיקות אימונופלואורסצנציה תוך שימוש באנטי-סרום ראשוני של ארנב נגד חלבון לא-מבני 1 (NS1) ונוגדן משני מסוג goat anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) המשוייך ל-Cy3 (אדום). הגרעינים נצבעו ב-4',6-diamidino-2-phenylindole (כחול). תמונות האימונופלואורסצנציה מוצגות על גבי תמונות ה-differential interference contrast התואמות להן. (C) תנובת נגיף. התאים גודלו בצלחות תרבית של 150 מ"מ. ייצור של ויריונים זיהומיים שהצטברו בעלויות התרבית של תאים שעברו אלקטרופורציית RNA ב-22 ו-40 שעות לאחר הטרנספקציה (hpt) נבדק באמצעות בדיקות פלאקים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Alpha Minimal Essential Medium	Life Technologies (Gibco)	12561-049
אגרוז	Lonza	50004
מבחנה קונית (50 mL)	VWR	21008-242
קריסטל ויולט	Sigma-Aldrich	C0775
צלחת תרבית (150 mm)	TPP	93150
קוvette (מרווח של 2-mm)	Harvard Apparatus	450125
סרום עוברי בקר	Life Technologies (Gibco)	16000-044
פורמלהיד	Sigma-Aldrich	F1635	רעיל ומסרטן
גלוטמין	Life Technologies (Gibco)	25030-081
Minimal Essential Medium	Life Technologies (Gibco)	61100-061
פניצילין/סטרפטומייצין	Life Technologies (Gibco)	15070-063
אשלגן כלוריד	Sigma-Aldrich	P3911
אשלגן פוספט מונובסי	Sigma-Aldrich	P9791
פלטה של שש בארות	TPP	92006
נתרן כלוריד	Sigma-Aldrich	S3014
נתרן פוספט דיבסי	Sigma-Aldrich	S3264
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies (Gibco)	25200-056
ויטמינים	Sigma-Aldrich	M6895
אינקובטור CO₂	Thermo Scientific	Heracell 150i
צנטריפוגה שולחנית	Thermo Scientific	ST16R
אלקטרופורטור	Harvard Apparatus	ECM 830