תרבויות cerebellar Organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי

סיכום

שיטה זו מתארת ​​את הדור של תרבויות cerebellar organotypic ואת ההשפעה של גירויים מסוימים אפופטוטיים על הכדאיות של סוגי תאים שונים cerebellar.

תקציר

תרבויות Organotypic של רקמה עצבית הוצגו לראשונה בשנת 1947 על ידי הוג ^1,2 ו היוו פריצת דרך בתחום מדעי המוח. מאז, הטכניקה פותחה עוד יותר, וכיום ישנם דרכים רבות להכין תרבויות organotypic. השיטה המוצגת כאן הותאמה מזו המתוארת על ידי Stoppini et al. להכנת פרוסות ומן Gogolla et al. עבור ההליך מכתים ^3,4.

תכונה ייחודית של הטכניקה הזו הוא שהיא מאפשרת לך ללמוד בחלקים שונים של המוח כגון ההיפוקמפוס במוח הקטן או במבנה המקורי שלהם, מתן יתרון גדול על פני תרבויות ניתק שבו כל ארגון הסלולר רשתות נוירונים הם שיבשו. במקרה של המוח הקטן זה עוד יותר יתרון משום שהוא מאפשר את המחקר בתאי פורקינג', קשה מאוד להשיג כתרבות העיקרית ניתק. שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור תכונות התפתחותי מסוים של המוח הקטן במבחנה, כמו גם עבור ניסויים אלקטרו תרופתי מסוג שני בר עכברים שעברו מוטציה.

השיטה המתוארת כאן נועד לחקור את ההשפעה של גירויים אפופטוטיים כגון ליגנד פאס במוח הקטן המתפתח, באמצעות מכתים TUNEL למדוד מוות של תאים אפופטוטיים. אם מכתים TUNEL משולב עם סמנים סוג תא מסוים, כגון Calbindin עבור תאים פורקינג', אפשר להעריך מוות של תאים באופן תא אוכלוסייה ספציפיים. מכתים Calbindin גם משרתת את המטרה של הערכת האיכות של תרבויות cerebellar.

פרוטוקול

1. תרבויות cerebellar Organotypic:

1. כדי ליצור בהצלחה תרבויות cerebellar organotypic להשתמש בעכברים בין P0-P3 או P8-P12. לצורך ניסוי שלנו השתמשנו עכברים בטווח P8-P12 כי זה שלב התפתחותי היה מתאים יותר במחקר שלנו.
2. הכן את לנתיחה ואת בינוני תרבות:
   1. דיסקציה המוח והכנת פרוסה מתבצעות מלאכותית נמוך נוזל המוח והשדרה נתרן (ACSF) המכיל סידן כלוריד 1mm, 10mm D-גלוקוז, 4mm אשלגן כלורי, מגנזיום כלוריד 5mm, סודיום ביקרבונט 26mM, סוכרוז 246mM פתרון פנול אדום (1:1000) , pH 7.3. כדי לעקר את הפתרון, לסנן אותה דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C.
   2. פרוסות cerebellar הם בתרבית 75% מינימום בינוני הנשר חיוניים (ממ), 25% חום מומת סרום סוס, HEPES 25mm, 1mm גלוטמין, 5 מג / מ"ל ​​גלוקוז, פניצילין (100 U / mL) וסטרפטומיצין (100 U / mL). סינון בינוני דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לכל היותר שבועיים.
3. לנתח מוח קר כקרח בינוני ACSF מבעבע בעבר עם Carbogen (95% חמצן ופחמן דו חמצני 5%) שים לב, כי הרוויה עם Carbogen תשנה את ה-pH של התמיסה כך יעבור מאדום לכתום. דיסקציה צריכה להתבצע במינימום זמן אפשרי נזהרים שלא לפגוע במבנה המוח.
4. פורסים את המוח בסעיפים sagittal של 400 מיקרומטר באמצעות vibratome.
   1. ביצוע חתך sagittal בסכין גילוח בהמיספירה אחת, מנסה לחתוך כמה שפחות של המוח הקטן, זה יספק משטח שטוח עבור חיתוך. קליפת המוח משמשת רק תמיכה על מנת להפוך את חיתוך קל אך מאז היא נושא חשוב זה נוח יותר לחתוך את החצי מקורי של קליפת המוח עם סכין גילוח.
   2. השתמש cyanoacrylate (הפלא) כדי לתקן את המיקום של המוח על הצלחת vibratome מתכת. חשוב לצנן את הצלחת על הקרח לפני הוספת דבק להפיץ אותו היטב בעזרת קצה של הצינור כדי ליצור שכבת דבק דקה. אם יש עודף של הפלא, זה יהיה לנתק מהצלחת כשמדובר במגע עם ACSF ואת מדגם יאבדו.
   3. ברגע שהמוח מחובר הצלחת vibratome, מספיק להוסיף מדיה ACSF כדי לכסות את המוח לשים קרח מתחת הצלחת לשמור את זה קר.
   4. חותכים פרוסות 400 מיקרומטר ולהעביר אותם עם פיפטה פסטר מפלסטיק (לחתוך את קצה להרחיב אותו ולמנוע נזק פרוסות) אל צלחת 6-גם תא המכיל תרבות ACSF על הקרח.
   5. הפרד את המוח הקטן משאר חלקי המוח בעזרת שני מזרקים אינסולין (מזרקים עם קוטר קטן 28-מד מחטים) תחת המיקרוסקופ לנתח. כמה פרוסות יהיה הפלא המצורפת את הקצוות: זה הרגע כדי לנסות להסיר את זה כמו שזה יכול להשפיע על הכדאיות של הפרוסה. חשוב לעשות זאת בזהירות מבלי לפגוע במבנה המוח הקטן.
5. מעבירים את פרוסות cerebellar עד 6-30mm היטב צלחות המכילות צלחת מוסיף תרבות עם נקבוביות 0.4 מיקרומטר. הוסף 1 מ"ל של התקשורת בתרבות לכל טוב, זה היה טרום מותנה הדגירה של לפחות 2 שעות ב 37 ° C ו 5% CO ₂ (בתרבות תא חממה). מניחים את מוסיף על גבי מדיה לוודא שאין בועות אוויר שנלכדו מתחת ולאחר מכן למקם את פרוסות המוח הקטן (1-3 לכל הכנס) על גבי מוסיף לוודא שהם המורחבת מלא וכי אין נוזל מכסה אותם. לשאוב עודף של התקשורת במידת הצורך. לדגור על 37 ° C ו 5% CO ₂ לשנות את התקשורת בכל תרבות 2 או 3 ימים. מומלץ להחליף רק חלק בינוני (למשל נפח ½) בבת אחת, שכן המדיום המשמש מכיל פרוסה הנגזרות trophic גורמים חשובים להישרדות התא.

2. פאס טיפול מכתים של Slices cerebellar:

1. לצורך ניסוי האתגר אפופטוטיים, אנחנו בתרבות הראשון פרוסות במשך 5 ימים שינוי התקשורת ביום במבחנה 3 (DIV3). ביום DIV5 תרבויות מטופלים עם 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של Jo2 אגוניסט פאס נוגדן ידי הוספתו ישירות לתקשורת על מנת לקבל רקע נקי של מוות של תאים מאז השינויים של התקשורת יכול לגרום כמה התמותה התרבויות. מחצית הבארות הם מטפלים כפקדי.
2. לאחר 24 שעות להסיר את המדיה מתחת מוסיף את ידי יניקה. כדי לתקן את הפרוסות, להוסיף 1 מ"ל של קרים כקרח PFA 4% מתחת ו 1 מ"ל לעיל להכניס את. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
3. לאחר 10 דקות להסיר את PFA לשטוף קצר עם PBS קר.
4. הבא להסיר את PBS ולהוסיף 1 מתחת מ"ל ו 1 מ"ל לעיל להכניס של מתנול קר כקרח 20% PBS ו דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
5. שטפו שוב עם PBS ולהוסיף 1 מ"ל ו 1 מ"ל מתחת מעל להכניס את של 0.5% Triton-X-100 ב PBS עבור permeabilization. דגירה למינימום של 12 שעות ב 4 ° C.
6. לאחר permeabilization, בלוק עם BSA 20% PBS עבור מינימום של4 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C. בשלב זה הפרוסות יכולים להישמר פתרון חסימת לפחות 3 ימים 4 ° C.
7. על מנת כתם הפרוסות בזהירות לחתוך את פיסת קרום להכניס המצורפת הפרוסה cerebellar ולהעביר אותו 24 גם צלחות המכילות PBS.
8. Immunostaining נעשית ברצף, תחילה לשעה אחת ואז עם נוגדן Calbidin לילה עם מגיב TUNEL.
   1. לשאוב PBS ולהוסיף 250 μL את מגיב TUNEL לתוך זה גם לוודא שהוא מכסה את כל פני השטח של הפרוסה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת בחושך.
   2. אחרי שעה להסיר את תערובת TUNEL ולשטוף עם PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות.
   3. לאחר לשטוף האחרון, להסיר את PBS ולהוסיף 250 μL של דילול 1 / 1000 של הנוגדן Calbindin ב PBS ו דגירה לילה בשעה 4 ° C בחושך.
   4. הסר את הפתרון נוגדן ראשוני ולשטוף עם PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות.
   5. הוספת 250 μL של נוגדנים משני בדילול 1 / 500 ב PBS ו דגירה של לפחות שלוש שעות בטמפרטורת החדר בחושך. הערכה TUNEL השתמשנו התווית TMR אדום, ולכן נוגדנים משני שלנו Calbindin הוא מצומדות כדי Alexa-488.
   6. לשטוף שלוש פעמים במשך 10 דקות עם PBS ואת ההר פרוסות גבי זכוכית מיקרוסקופ באמצעות התקשורת הרכבה המכיל DAPI.
   7. תמונה הפרוסות עם מיקרוסקופ confocal באמצעות 488 nm ו 561 nm עירור wavelenght עבור Calbindin ו TUNEL בהתאמה.

3. נציג תוצאות:

האתגר העיקרי של פרוטוקול זה להיות מסוגל ליצור בריא תרבויות פרוסה cerebellar, במיוחד מאז readout הסופי שלנו יהיה מוות של תאים. תרבות בריאה מופיע אחד שבו שכבת גוף התא הוא שקוף ומאפשר לך לראות את המבנה foliated של המוח הקטן מתחת למיקרוסקופ (איור 1). אחרי כמה ימים בתרבות פרוסות מתחילים התאים דק ולא נוירונים ניתן לצפות נודדות הרחק בשוליים של הפרוסה. התאים עגול כהה (מקרופאגים סביר ביותר) שמכסים את פרוסות אחרי כמה ימים בתרבות, בסופו של דבר לירידה במספר לאחר 10-14 ימים במבחנה (איור 2) ^5. ההוכחה האולטימטיבית עבור לקיומה של פרוסות היא כתם על סמנים סלולריות שונות, כגון Calbindin עבור התאים פורקינג'. איור 3 מראה תמונה נציג מיקרוסקופ confocal של שכבת תאים פורקינג' עם גרעינים TUNEL מספר חיובי.

חשוב לקחת בחשבון כי גם אם כמה פרוסות קיבל גירוי אפופטוטיים, הם נחשפו רק למשך 24 שעות. זה איפשר מספיק זמן כדי לבחון פיצול ה-DNA בתאים מתים עם מכתים את TUNEL, אבל תא מוגדר שכבת פורקינג' עדיין נוכח.

באיור 1. פרוסה cerebellar בריא DIV2. תמונה זו מציגה את תא שקוף הגוף שכבת ומבנה cerebellar foliated ב פרוסה בריא.

איור 2. פרוסה cerebellar בריא ב DIV 7. בתמונה זו אנחנו עדיין יכולים לראות את המבנה foliated של המוח הקטן ואת המראה של גופי התא כהה.

איור 3. תמונה נציג פרוסה פאס שטופלו cerebellar. Confocal תמונה זו מראה את התאים פורקינג' מוכתם Calbindin (ירוק) לבין תאים אפופטוטיים חיובית מכתים TUNEL (אדום). תאים פורקינג' אינם מופיעים בשורה אחת, אלא מקובצים היוצרים מבנה דמוי folium.

דיון

שיטה זו מתארת ​​את אחד יישומים אפשריים רבים של תרבויות organotypic עצבי והיא אפשרה לנו ללמוד את ההשפעה של גירויים אפופטוטיים בסוג בר פרוסות cerebellar מוטציה.

החלק הקריטי ביותר של ניסוי זה הוא להיות מסוגל לייצר בעקביות בריא תרבויות פרוסה cerebellar. הגורמים העיקריים הם לנתיחה וטכניקה לחתוך את היכולת לבצע את הפרוטוקול בזמן שפחות, אבל באותו הזמן נזהר לא לפגוע פרוסות. גורם נוסף חשוב הוא הכנה הרכב של התקשורת תרבות, תרבויות אלה רגישים מאוד, ולכן היינו צריכים לבדוק כמה מתכונים המותגים ואת התקשורת. גם קבוצות שונות של סרום או כל רכיב אחר של התקשורת להשפיע על הכדאיות של הפרוסות. קיבלנו את התוצאות הטובות ביותר עם סרום הסוס ממגרש Invitrogen # 480116.

לאחר פרוסות cerebellar נוצרות אחד יכול ללמוד פיתוח cerebellar, electrophysiology, הישרדות התא לבד או בתגובה לגירויים אפופטוטיים, excitotoxicity או מחסור בחמצן. מחקרים השוואתיים באמצעות סוג בר פרוסות cerebellar מוטציה כבר תובנה מאוד בהיבטים רבים של פיתוח פונקציה cerebellar ו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
MEM	Invitrogen	11090
סרום סוסים	Invitrogen	16050
Hepes	Invitrogen	15630
גלוטמין	Invitrogen	25030
פניצילין/סטרפטומייצין	Invitrogen	15140
דבק מהיר (Superglue)	Krazy Glue
פלטות תרבית תאים 6 בארות / 24 בארות	Corning	3506/ 3527
הכנסות (inserts) לפלטת תרבית 30mm (נקבוביות 0.4-μm)	EMD Millipore	PICM03050
נוגדן Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) מופק NA/LE	BD Biosciences	554254
ערכה לזיהוי מוות תאי In situ, TMR red	Roche Group	12 156 792 910
נוגדן Rabbit anti-Calbindin D-28k	Swant	CB-38a
נוגדן משני Alexa 488-goat anti-rabbit IgG	Invitrogen	A-11008
תווך קיבוע Vectashield עם DAPI	Vector Laboratories	H-1200
מיקרוסקופ דיסקציה	Carl Zeiss, Inc.
ויברטום (Vibratome)	Leica Microsystems
מיקרוסקופ קונפוקאלי	Leica Microsystems