כדי להעריך את In vivo ההשפעות של התערבויות טיפוליות במחלות שרירים, שיטות יש צורך לכמת דור בכוח עיפנות בשריר המטופל. אנו פרט גישה להערכת Myo-מכניות בשריר explanted hindlimb העכבר. ניתוח זה מספק גישה חזקים כדי quantitating את ההשפעות של הנדסה גנטית על תפקוד השרירים, כמו גם השוואה של טיפולים בעכברי מודל של מחלת שרירים.
במאמר זה
סיכום
תקציר
כדי להעריך את ההשפעות של vivo של התערבויות טיפוליות לטיפול במחלת שריר 1,2,3, שיטות כמותיות יש צורך למדוד כוח הדור עיפנות בשריר המטופל. אנו מתארים גישה מפורט להערכת Myo-מכניות בשריר hindlimb explanted טרי מן העכבר. אנו מתארים את הבציר atraumatic של השריר digitorum longus עכבר extensor, מקבע את שריר רצועת שרירים myograph (דגם 820MS, דנית טכנולוגיה מיו), וכן מדידה של עווית מירבית מתח tetanic, זמן התכווצות, וחצי הרפיה זמן, באמצעות רבוע ממריץ הדופק (דגם S48, טכנולוגיות דשא). בעזרת מדידות אלה, אנחנו מדגימים את החישוב של עווית מסוימת ומתח tetanic מנורמל לשטח חתך השריר, עווית ל-tetanic יחס מתח, עקומת כוח בתדירות היחסים עקומת תדר נמוך עייפות 4. ניתוח זה מספק שיטה כמותית להשוואה בין התערבויות טיפוליות בעכברי מודל של מחלת שריר 1,2,3,5, וכן השוואה של ההשפעות של הנדסה גנטית על תפקוד השרירים 6,7,8,9.
פרוטוקול
הפרוטוקול מתבצע באישור טיפול קליפורניה בסן פרנסיסקו מוסדיים בעלי חיים ועדת שימוש (IACUC).
1. Dissection של Longus extensor Digitorum מאוס (אדי) שרירים
- בצע את כל הנהלים בעל חיים בהתאם להנחיות מוסדיים.
- להרדים חיה עם 200 העקירה מ"ג / ק"ג pentobarbital / צוואר הרחם intraperitoneal קצר לפני הקציר שריר 10. דיסקציה צריך להיות מתורגל היטב, כך שריר ניתן לקצור ועלה ב מתמר את המתח בתוך 15 דקות של המתת חסד.
- סדר פרקדן פגר על מגש לנתיחה והרגל להצמיד למגש.
- תחת מיקרוסקופ tibialis לנתיחה, העור פתוחות, fascia לפתוח בזהירות (Fig.1A), וכן לקלף מן הקרסול כלפי מעלה כדי לחשוף את אדי (Fig.1B). השתמש טיפות של תמיסת Ringer של lactated כדי לשמור על השריר לח שנאגרו במהלך הקציר.
- הסר אדי, שימור כמו גיד האפשר בכל קצה, והכניס לתוך צלחת פטרי המכילה פתרון Ringer של lactated. עניבה תפר לכל אחד הגידים שרירים (Fig.1C). זה חיוני כי סיבי השריר לא לגעת או מופרע במהלך הניתוח.
2. הרכבה של אדי עכבר Myograph רצועת שרירים
- עבור מחקרים אלה, אמבטיה רקמות נחוצה שמחבר את השריר ובמקביל לאפשר לו לרחוץ בתמיסה פיזיולוגית בטמפרטורה קבועה עם חמצון רציפה. אמבטיה היא יחד עם מתמר כוח למדידת מתח שרירים. אנו מעסיקים שרירים משולב רצועה myograph אמבטיה מדנית מיו וטכנולוגיה (DMT דגם 820MS) למטרה זו. בנוסף, ממריץ דופק מרובע חשמלי (דגם S48 גראס) ואת פלטפורמת נתונים הרכישה (ADInstruments PowerLab System Data Acquisition ותוכנה LabChart) נדרשים כדי להפיק, להקליט ולנתח מיו מכני התגובות, בהתאמה. 820MS DMT יש אלקטרודות פלטינה משולבים לכסות את החדר הממוקמים משני צדי השריר, בחלק באמצע של רצועת השריר. Myographs אחרים עשויים לדרוש תשומת לב ספציפית מיקום האלקטרודה.
- מלאו אמבטיה myograph עם 5 מ"ל פתרון Henseleit קרבס 11. חם על 25 ° C. הבועה O 2 / CO 2 (95% / 5%) דרך אמבטיה במשך 15 דקות לפני השימוש.
- השתמש כדי להרחיב את התפרים בין אדי מלחציים של myograph ומאובטח הגידים של שריר אדי (Fig.1D, E) בין מלחציים. היזהרו שלא לצבוט את השריר עצמו.
- שמרו על אמבטיה myograph במהירות של 25 ° C.
3. מיו מכני ניתוח
א המתח עווית
- אורך הגדר הראשוני באמבטיה כך שאין רפיון שרירים.
- קבע גירוי מקסימלי (משך 0.5 ms) על ידי התאמת מתח על מנת לקבל מתח עווית מקסימלי, ולאחר מכן להגדיר גירוי של 20% מעל מקסימלי (כדי להשיג גירוי supramaximal). במחקרים שלנו, הגירוי supramaximal מושגת בדרך כלל פלט של 40 וולט.
- בדיקת פלט ממריץ באמצעות אוסצילוסקופ.
- קביעת אורך אופטימלי בהדרגה על ידי מתיחת שרירים עד אין עלייה נוספת במתיחות עווית.
- אפשר שרירים לאזן דקות 3.
- לספק גירוי supramaximal מרובע (0.5 ms) באריכות אופטימלי באמצעות S44 גראס ממריץ אלקטרוניים, תפוקת שיא.
- שיא: מתח עקומת עווית (P t לעומת זמן; Fig.2A).
ב מתח טטנוס
- אפשר שרירים לנוח 3 דקות.
- החלת הרכבת של גירויים supramaximal עבור 300msec ב 150 הרץ באריכות אופטימלי באמצעות S44 גראס ממריץ אלקטרוניים, תפוקת שיא.
- שיא: מתח טטנוס עקומה (P o זמן vs; Fig.2B).
ג חיל בתדר
- אפשר שרירים לנוח 3 דקות.
- חיל תדר: להחיל הרכבות של גירויים supramaximal ב 30, 60, 100, 140, ו 160 הרץ עם 3 דקות מנוחה בין כל גירוי (Fig.3). לחלופין, ניתן להחיל רכבות 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 100, 140 ו - 160 הרץ רזולוציה טובה יותר בתדרים נמוכים, שם השינויים כוח משמעותית.
- עלילה: כוח בתדירות יחסי (כוח מקסימלי% לעומת תדירות גירוי).
ד עייפות
- החל הרכבת של tetani קצר: 60 הרץ 300 מילישניות (או תדירות מותאם לייצר 50% לשיא הכוח), כל 3 שניות למשך 10 דקות. עד 10 דקות, הכוח tetanic צריך לרדת לרמה לרמה של 15% ~ של הערך הראשונית (Fig.4).
- עלילה: עייפות בתדירות נמוכה (כוח מקסימלי% לעומת תקופה).
א אוסף נתונים נוספים בסוף הפרוטוקול
- לפני unmounting השריר מן myograph, הגדר את muscle באריכות אופטימלית כפי שנקבע בשלב III.A.4 ולמדוד קוטרו או באמצעות עינית על מיקרוסקופ או עם מחוגה. חישוב חתך באזור (מיקרומטר 2).
- מדד מסת שריר (מ"ג) על ידי הסרת התפרים ומשקלו השריר.
- לשקול את העכבר כדי להעריך מסת הגוף (GM).
4. חישובים
- שריר: מסת הגוף = יחס
מסת הגוף / שרירים המונית - המתח עווית, P t (mn) =
המתח המקסימלי שנוצר במהלך עווית - עווית מתח ספציפיים (N / cm 2) =
עווית מתח (mn) / חתך באזור (מיקרומטר 2) x 10 5 N / mn • 2 מיקרומטר / 2 ס"מ - זמן למתח השיא (ms) =
זמן מתחילת ההתכווצות למתח המקסימלי - חצי רגיעה הזמן (ms) =
זמן מהמתח שיא 50% מתח שיא - המתח Tetanic, P O (mn) =
המתח המקסימלי שנוצר במהלך טטנוס - המתח tetanic ספציפיים (N / cm 2) =
tetanic מתח (mn) / חתך באזור (מיקרומטר 2) x 10 5 N / mn • 2 מיקרומטר / 2 ס"מ - קצב מקסימלי של עליית טטנוס (N / s) =
השיעור המרבי של העלאת מתח במהלך עליית המתח טטנוס, כלומר השיפוע המרבי של עקום מתח tetanic (או DP O / dt) - חצי רגיעה tetanic מתח (ms) =
זמן של הפסקת הגירוי 50% המתח על הפסקת הגירוי - עווית מתח ל-tetanic יחס מתח, P t / P מ =
עווית המרבי מתח / המרבי tetanic מתח - עייפות מדד =
היחס בין המתח לאחר שתי דקות של עייפות בתדר נמוך למתח איזומטרי מקסימלי
5. נציג תוצאות
באיור 1. Dissection של שריר אדי. חשיפה, של hindlimb muscles.TA, tibialis הקדמי. B, חשיפה של השריר (extensor digitorum longus) אדי. C, Attachment של התפרים כדי גידים אדי. D, מתמר מתח אמבטיה (מבט מהצד). E, רכוב אדי באמבטיה (מבט מלמעלה). שריר שקוע חלקי במאגר לצורכי המחשה; בפועל, השריר צריך להיות שקוע לחלוטין כדי למנוע מהתייבשות.
איור 2. דוגמה של עקומות מתח. למשל, עווית של עקומת המתח הממחישות מתח עווית מקסימאלית (P t), זמן הכיווץ (CT) וחצי הרפיה זמן (HRT). בר, 1s. B, דוגמה של עקומת המתח tetanic מראה מתח tetanic מקסימאלית (P o) ו חצי רגיעה tetanic מתח (HRTT). בר, 1s.
איור 3. דוגמה של ניתוח כוח בתדירות היחסים. , המתח שנוצר על ידי גירוי תדרי מצטבר. B, דוגמה לאמן הדופק 30MHz. בר, 80ms. C, דוגמה לאמן הדופק 140MHz. בר, 80ms. D, דוגמה של עקומת כוח בתדירות הנגזרת הנתונים המוצגים. הצורה של עקומת כוח בתדירות אופיינית של כוח שריר, ניתן להשוות בין השרירים של בעלי חיים שונים.
איור 4. דוגמה של ניתוח בתדר נמוך ועייפות. , מתחים Decremental שנוצר על פני תקופה של stimulation.Examples תדירות נמוכה של רכבות הדופק בנקודות הזמן המצוין (B, C, D) מוצגים להלן. E, דוגמה של עקומת עייפות בתדר נמוך נגזר הנתונים המוצגים. צורת עקומת תדר נמוך עייפות אופיינית של כוח שריר, ניתן להשוות בין השרירים של בעלי חיים שונים.
דיון
אנו מתארים גישה מפורט להערכת Myo-מכניות בשריר hindlimb explanted מן העכבר. אדי, בעוד יותר קשה לנתח בגלל המיקום האחורי שלה מאחורי השריר הקדמי tibialis, קל יותר להעריך מאשר הקדמי tibialis בגלל המצורפים tendinous הבולטים שלה הקרסול והמפרקים הברך. גידים אלה להקל גובר myograph רצועת השריר. לעומת זאת, לגשת בקלות רבה יותר tibialis הקדמי יש מצורף רחבה, atendinous כמעט במפרק הברך, מה שמקשה במיוחד על שני לנתח מבלי להתפשר על שריר, הר בבטחה myograph. כמו כן, אנו מציינים כי שתפחו והלכו השריר באמבטיה מחומצן במאגר טמפרטורה פיזיולוגיים חיונית לשימור תכונות מכניות של השריר. מצאנו כי אנו יכולים לחזור על הניתוח הזה עד 30 דקות ללא שינויים משמעותיים בתגובה שריר בתנאים אלה. לבסוף, חשוב כי סיבי השריר לא להיות נגע במהלך דיסקציה ונהלים הרכבה, כמו זו יכולה להיות השפעה שלילית על תפקוד השרירים, ואת התוצאה של הערכה נמוכה מדי כוח מיו מכניות. על ידי ביצוע הליכים אלה, ניתוח זה מספק גישה כמותית חזקים כדי להעריך את ההשפעות של הנדסה גנטית על תפקוד השרירים 6,7,8,9, כמו גם השוואה בין התערבויות טיפוליות בעכברי מודל של מחלת שריר 1,2,3,5 .
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי שירות הבריאות הציבורי גרנט (HL086513) מ NHLBI כדי PEO, וכן מענק מחקר מקיף של המכון בקליפורניה הרגנרציה לרפואה (RC1-00104), שירות הבריאות הציבורי גרנט (HL085377) מ NHLBI ו מתנה מקרן Pollin ל HSB
SC נתמך על ידי המכון בקליפורניה גשרים הרגנרציה לרפואה על המחקר בתאי גזע פרס (TB1-01194) לסן פרנסיסקו סטייט.
חומרים
פתרונות מדיה
Lactated Ringer של פתרון
- 100 mM NaCl
- 30 מ"מ CH3CH (OH) COONa (לקטט סודיום)
- 4 מ"מ KCl
- 1 mM CaCl 2 2H 2 O (dihydrate סידן כלוריד)
- כדי להתאים את pH 6.75
קרבס פתרון Henseleit
- 118 mM NaCl
- 4.7 mM KCl
- 1.25 mM CaCl 2
- 1.2 mM MgCl 2
- 1.2 mM KH 2 PO 4
- 25 mM NaHCO 3
- 11 mM גלוקוז
- כדי להתאים את pH 7.2-7.4 ידי equilibrating עם O 2 / CO 2 (95% / 5%) גז
Pentobarbital
- 5 מ"ג / מ"ל פתרון עובד מים סטריליים
מקורות
- Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue. Neuromuscul Disord. 17, 47-55 (2007).
- Messina, S. VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice. FASEB J. 21, 3737-3746 (2007).
- Danieli-Betto, D. Sphingosine 1-phosphate protects mouse extensor digitorum longus skeletal muscle during fatigue. Am J Physiol Cell Physiol. 288, C1367-C1373 (2005).
- MacIntosh, B. R., Willis, J. C. Force-frequency relationship and potentiation in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol. 88, 2088-2096 (2000).
- Hayes, A., Williams, D. A. Contractile properties of clenbuterol-treated mdx muscle are enhanced by low-intensity swimming. J Appl Physiol. 82, 435-439 (1997).
- Coulton, G. R., Curtin, N. A., Morgan, J. E., Partridge, T. A. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: II. Contractile properties. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 299-314 (1988).
- Danieli-Betto, D. Deficiency of alpha-sarcoglycan differently affects fast- and slow-twitch skeletal muscles. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 289, R1328-R1337 (2005).
- Chan, S. A gene for speed: contractile properties of isolated whole EDL muscle from an alpha-actinin-3 knockout mouse. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C897-C904 (2008).
- Personius, K. E. Grip force, EDL contractile properties, and voluntary wheel running after postdevelopmental myostatin depletion in mice. J Appl. , Forthcoming (2010).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Curr Protoc Immunol. Chap 1, (2006).
- Beekley, M. D., Wetzel, P., Kubis, P., Gros, G. Contractile properties of skeletal muscle fibre bundles from mice deficient in carbonic anhydrase II. Pflugers Arch. 452, 453-463 (2006).
הדפסות חוזרות והרשאות
