תרגיל מסוגל גרימת מות תאים מתוכנת בתאי המערכת החיסונית. ישנן מגבלות מדידה שונים, בעיקר בנוגע לכמות הזמן הדרוש כדי לבודד ולטפל דגימת דם לפני האבחון. הפגינו הוא הליך מהיר פולשנית לניתוח אפופטוזיס האימון המושרה לימפוציטים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אצבע מקל דגימה דם מתודולוגיה לקביעת אפופטוזיס-תרגיל המושרה הלימפוציטים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
פעילות גופנית היא גירוי פיזיולוגי מסוגל גרימת מות תאים מתוכנת בתאי המערכת החיסונית. עד כה, מגבלות שונות זוהו עם המדידה של תופעה זו, במיוחד בנוגע למשך הזמן הנדרש כדי לבודד ולטפל דגימת דם לפני ההערכה של מוות של תאים. בגלל זה, קשה לקבוע האם עליות דיווח אפופטוזיס תא החיסון ניתן תרמו ההשפעה בפועל של פעילות גופנית על המערכת, או השתקפות של זמן עיבוד צורך בסופו של דבר להשיג את המדידה. במאמר זה אנו מדגימים הליך מהיר פולשנית לניתוח אפופטוזיס האימון המושרה לימפוציטים. שלא כמו טכניקות אחרות, דם כל מתווסף פאנל נוגדן מיד עם קבלת המדגם. לאחר תקופת הדגירה, כדוריות דם אדומות lysed דגימות מוכנים להיות מנותח. השימוש בנוהל אצבע מקל דגימה מקטין את נפח הדם הנדרש, מקטינה את אי נוחות לנבדקים.
פרוטוקול
1. Finger-Stick דם דגימה
- איסוף דם נלקחת בדרך כלל כל למדידת קו בסיס (בדרך כלל לאחר 10-15 דקות מנוחה בישיבה), במהלך או מיד לאחר התקף התעמלות, לאורך כל התקופה שלאחר האימון במנוחה (בדרך כלל בין 1-3 שעות לאחר הפסקה של תרגיל).
- באמצעות אמצעי זהירות יוניברסל, קודם לחטא את האצבע עם אלכוהול איזופרופילי 70%.
- לנקב הבא, האתר באמצעות אזמל אוטומטיות או מכשיר דומה. למרות שאנו משתמשים 30-Lancet מד לספק לנוחות הנושא, מחט מד גדול יכול להיות מנוצל.
- לנגב את טיפת הדם הראשונה, ולאחר מכן לאסוף דם לתוך צינורות או microvettes נימי שטופלו הפרין ליתיום כדי למנוע קרישה.
2. תא Phenotyping והכתים אפופטוזיס
- הוסף 10 μL דם כל heparinized ללוח נוגדן titred במאגר 250 מחייב μL (ראה טבלה 1 סכמטית). השתמשנו גורם לדילול 1:20 עם הצלחה, אבל כל מעבדה צריכה titre ריאגנטים שלהם כדי לקבוע את הפתרון הטוב ביותר לעבוד.
1. טבלת נוגדן פאנל להגדרה של אפופטוזיס התעמלות-Induced תת ליקוציט. אפופטוזיס מוקדם הוגדרה על ידי ביטוי של Annexin V, בעוד אפופטוזיס מאוחר הוגדרה על ידי תיוג חיובי כפול עם Annexin V ו-7-AAD. תאים נקרוטי היו Annexin V-7 ו-AAD + תאים בלבד.Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4 תאים רק צינור Annexin V - FITC Annexin V - FITC Annexin V - FITC CD4 האדם האנטי - PE נגד אדם CD8 - PE נגד אדם CD19 - PE 7-AAD 7-AAD 7-AAD נגד אדם CD45RA - APC נגד אדם CD45RA - APC
7-AAD = 7-אמינו actinomycin-D, APC = Allophycocyanin, CD4 = Helper לימפוציטים מסוג T, CD8 מדכא = / ציטוטוקסיות לימפוציטים מסוג T, CD19 = B לימפוציטים, CD45RA = תת תא נאיבי, FITC = isothiocyanate והעמסת, PE = Phycoerythrin. - דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 30 דקות.
- צנטריפוגה XG ב 1075 למשך 5-10 דקות.
- למזוג, להוסיף 300 תא דם אדום μL הצפת תמוגה, וביסודיות מערבולת.
- דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- הוספת 300 PBS μL להפסיק התגובה RBC תמוגה.
- צנטריפוגה XG ב 1075 למשך 5-10 דקות.
- למזוג, מתלה, ולהוסיף 50 חיץ מחייב μL.
- ניתוח על ידי cytometry הזרימה.
מומלץ כי לכל הפחות, את הפקדים הבאים להיות מנוצל: תאים רק צינור לשמש מלאה שלילי באיתור autofluorescence רקע, וצינורות המכיל בנפרד fluorochrome לקבוע פיצוי במהלך הראשוני של cytometer להגדיר את הזרימה. בנוסף, השתמשנו תקן חרוזים פיצויים בהצלחה להגדיר ניסויים שלנו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אוסף פולשנית מדגם הליך ניתוח שלאחר מכן באה לידי ביטוי לניתוח שלבי בשלבים מוקדמים ומאוחרים של אפופטוזיס האימון המושרה לימפוציטים. ניתן גם בבירור לכלול תאים אלה, המהווים נמקי, ולא אפופטוטיים. הליך זה מתגבר על החסרונות ואי נוחות הקשורה venipuncture פולשנית מאזור antecubital בנקודות זמן רבות לפני, במהלך, מיד לאחר האימון, או הבטחת קטטר למשך התקף התרגיל. מבחינת החוקרים, נהלים כאלה בדרך כלל דורשים הכשרה מיוחדת phlebotomy, שלא כל אדם צריך. בנוסף, נושא גיוס ושימור צפויה להיות משופרת באמצעו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
מחקר זה מומן על ידי מענק הפקולטה חדש מהמועצה הפקולטה מלגות בבית המערבי אוניברסיטת קנטאקי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| בופר קישור לציטומטריית זרימה | eBioscience | 00-4222-26 | ||
| בופר להמסת תאי דם אדומים (RBC Lysis Buffer) | eBioscience | 00-4333-57 | ||
| מכשיר דקירה | Accu Check Soft Touch | Roche Group | ||
| צינורות קפילריים | צינורות קפילריים עם הפרינה | Chase Scientific Glass, Inc. | 501 | |
| צנטריפוגה | GmC Lab | Gilson, Inc. | PMS-880 | |
| Annexin V-FITC מצומד | Biovision Inc. | K201-400-1 | ||
| CD4-PE מצומד | Anti-human, clone RPA-T4 | eBioscience | 12-0049-42 | |
| CD8-PE מצומד | Anti-human, clone OKT8 | eBioscience | 12-0086-73 | |
| CD19-PE מצומד | Anti-human, clone HIB19 | eBioscience | 12-0199-42 | |
| תמיסת צביעת חיוניות 7-AAD | eBioscience | 00-6993-50 | ||
| CD45RA-APC מצומד | Anti-human, clone HI100 | eBioscience | 17-0458-42 | |
| ציטומטר זרימה | C6 | Accuri |
מקורות
- Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans. Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).
- Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes. Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).
- Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise. J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).
- Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes. Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).
- Wang, J. -S., Huang, Y. -H. Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men. Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).
- Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status. Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).
- Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
