אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts

סיכום

התרבות של תאים נורמליים בהקשר שלהם תלת ממדי מייצג שיטה חלופית לחקור אירועים מוקדם נדרש שינוי tumorigenesis הסלולר. שיטה זו משמשת לגדול השחלות נורמלי תאים oviductal ללמוד האירועים מוקדם להיווצרות סרטן השחלות.

תקציר

סרטן השחלות הוא הגורם המוביל החמישי של מקרי מוות מסרטן בקרב נשים יש שיעור תמותה 63% בארצות הברית ^1. סוג תא המוצא עבור סרטן השחלות עדיין השאלה יכול להיות גם על פני השחלות אפיתל (OSE) או אפיתל דיסטלי של fimbriae את החצוצרה ^2,3. Culturing תאים נורמליים כתרבות ראשוני במבחנה יאפשר למדענים מודל שינויים ספציפיים שעשויים לגרום לסרטן השחלות האפיתל ברורים, ובכך לקבוע בוודאות את סוג התא המוצא. זה יאפשר פיתוח של סמנים ביולוגיים יותר מדויק, במודלים של בעלי חיים עם ספציפיים רקמות שינויים גן, אסטרטגיות מניעה טובה יותר ממוקד המחלה.

שמירה על תאים נורמליים הידרוג אלגינט לטווח קצר מקדמת תרבות של תאים במבחנה בהקשר שלהם תלת מימדי ומאפשרת המבוא של ה-DNA פלסמיד siRNA, ומולקולות קטנות. על ידי איברים culturing לחתיכות כי הם שנבעו מקיצוצים אסטרטגי באמצעות אזמל, תרבויות מספר מאיבר אחד יכול להיות שנוצר, הגדלת מספר ניסויים מבעל חיים אחד. קיצוצים אלו היבטים מודל הביוץ מוביל לשגשוג של OSE, אשר מזוהה עם היווצרות סרטן השחלות. סוגי תאים כגון OSE כי אינם גדלים היטב על משטחי פלסטיק יכול להיות מתורבת בשיטה זו ולהקל על חקירת תהליכים תאיים רגיל או את האירועים המוקדמים להיווצרות סרטן ^4.

הידרוג אלגינט יכול לשמש כדי לתמוך בצמיחה של סוגים רבים של רקמות ^5. אלגינט הוא פוליסכריד ליניארי מורכב יחידות חוזרות של חומצת-D-mannuronic β ו α-L-guluronic חומצה שניתן crosslinked עם יוני סידן, וכתוצאה מכך פעולה gelling עדין שאינו נזק לרקמות ^6,7. כמו אחרים תלת ממדי התרבות מטריצות תאים כגון Matrigel, אלגינט מספק תמיכה מכאנית עבור רקמות, אולם החלבונים אינם תגובתי עם המטריצה ​​אלגינט, ולכן פונקציות אלגינט כמטריצה ​​תאיים סינתטי שלא ליזום התא איתות ^5. הידרוג אלגינט מרחפת בתווך תא רגיל התרבות תומך ארכיטקטורת הצמיחה רקמות במבחנה.

השיטה מוצגת להכנת, הפרדה, והטבעה של השחלות חתיכות איברים oviductal לתוך הידרוג אלגינט, אשר ניתן לשמור על תרבות של עד שבועיים. לשחרר האנזימטית של תאים לניתוח דגימות RNA חלבונים מן התרבות איבר מתואר גם. לבסוף, את הצמיחה של תאים מסוגים ראשוני ניתן ללא הנצחה גנטי מעכברים היתרי החוקרים להשתמש בנוקאאוט ואת העכברים הטרנסגניים.

פרוטוקול

1. השחלות ביתור ובידוד רקמה

1. הכן פתרון 0.5% (w / v) של אלגינט הנתרן, להכין מגירסה שונה של הפרוטוקול שתואר לעיל ^5, באמצעות PBS סטרילית חום 37 ° C. מערבבים על ידי היפוך או נדנדה, אבל לא מערבולת. צייר את אלגינט לתוך מזרק 1 מ"ל עם מחט 25 G ולשמור על 37 ° C.
2. הכן 10mm סטרילי CaCl ₂ פתרון אלגינט crosslinking על אנקפסולציה רקמות חמים 37 ° C.
3. הכן 1mL של המדיום תרבות (αMEM + 5 יחידות פניצילין 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין) לכל היטב צלחת 24 היטב כל ניסוי. הכללת תרופות שונות, פפטידים, וירוסים או במדיום תרבות. עבור transfection לפני אנקפסולציה איברים, רקמות דגירה עם Lipofectamine 2000 ו-DNA פלסמיד במשך ארבע שעות בכל 37 ° C.
4. מנתחים את האיברים מן החיה, להסיר את כל רקמת שומן או שיורית, משוך בעדינות את הממברנה בורסה המקיפה את השחלה, לחתוך את השחלה או oviduct לארבעה חלקים על ידי שחצתה את האיבר. החיות היו מורדמים בחנק CO ₂ ואחריו נקע בצוואר הרחם. עבור oviduct, להשתחרר בעדינות את הרקמה על ידי משיכת לגזרים את הקרומים חיבור והארכת הקצוות של הצינור בכיוונים מנוגדים באמצעות מלקחיים לפני החיתוך.
5. מניחים טיפה אחת אלגינט (~ μL 1-3) על סיב רשת מעוקרים.
6. בעזרת מלקחיים סטריליות, להעביר חתיכת איבר לתוך אגל אלגינט והמרכז אגל באמצעות מלקחיים או מחט סטרילית.
7. היפוך אגל המכיל את חתיכת איבר (organoid) ידי אחיזה סיבים רשת עם מלקחיים סטריליות ולהפוך אותו הפוך, כדי לאפשר לכוח הכבידה אלגינט תוך ירידה תלוי.
8. הקש על מלקחיים על קצה צלחת פטרי המכילה 10 ס"מ 10mm CaCl ₂ פתרון, כך הירידה נופל לתוך פתרון.
9. דגירה במשך 2 דקות, מוציאים בכף סטרילית המכילה נקבוביות לשחרר תוספת 10mm CaCl _2, ולהעביר את המדיום לתרבות. עד ארבעה ג'ל אלגינט ניתן להעביר לתוך הבאר אחד של צלחת המכילה 24 היטב את המדיום לתרבות. תרבות לתקופת זמן מוגדרת.

2. הפירוק של אלגינט אוסף של תאים

1. עבור solubilization של ג'ל אלגינט, דגירה התרבויות lyase אלגינט (3.4 מ"ג / מ"ל) מומס L-15 של ליבוביץ התקשורת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או עד הג'ל נמס לחלוטין.
2. הסרת רקמה lyase אלגינט.
3. עבור אוסף של OSE, דגירה organoid עם 500 יחידות collagenase ב-L-15 של ליבוביץ התקשורת במשך שעה 1 ^8. וורטקס ב 2 פעימות השני (2 שניות מערבולת ו -2 שניות מנוחה) על כוח בינוני למשך דקה 1, ואחריו 1 פולסים השנייה (1 מערבולת השני 1 שאר השנייה) למשך דקה 1. בואו חתיכות איברים ליפול לתחתית של התחתית microcentrifuge ו supernatant פיפטה לתוך צינור טרי microcentrifuge סטרילית. צנטריפוגה 3 דקות ל 3000 סל"ד אפיתל פני השטח גלולה השחלות.
4. עבור אוסף של האפיתל חצוצרות, לחתוך את הצינור לאורך ומניחים על ניילון רקמה תרבות DMEM עם 5 יחידות פניצילין 5 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל ו -4% (v / v) FBS. במשך 3-5 ימים, התאים יהיה "לזחול" מתוך stroma חצוצרות ולגדול על תרביות רקמה plastic9.

3. קיבוע של במארז אלגינט תרבויות איבר עבור חלקים פרפין

1. אסוף את אלגינט במארז חרוז ממדיום התרבות בנקודת הזמן שנבחר.
2. Recrosslink אלגינט כדי להקשיח את הג'ל על ידי הטלת התרבות לתוך סטרילי פתרון 10mm ₂ CaCl במשך שתי דקות.
3. תקן את איבר אלגינט הגלום paraformaldehyde 2% סוכרוז המכילה 50 מ"מ, 10 mM CaCl ₂ ו 50 נתרן cacodylate mM על מנת להבטיח כי הג'ל נשאר מוצק מלא תמצית רקמות במהלך קיבעון.
4. בעקבות עיבוד רקמות, להטביע את תרבות שלמה אלגינט, במארז איבר לתוך חתיכת פרפין קטע עם microtome לייצר 5 סעיפים מיקרומטר.
5. אלגינט יפורק והוציאו משקופית אם ביצוע אימונוהיסטוכימיה עקב החום אחזור אנטיגן מבוסס. אלגינט תישאר כתם על eosin תחת עומד hematoxylin והכתים eosin.

4. נציג תוצאות:

דוגמה תרבות תלת מימדי איבר של השחלה ואת oviduct מוצג באיור 1. השחלות ניתן לחתוך לחתיכות בגודל שונה, OSE להתרבות ולהעביר לתקן את פני השטח כי נפצע מן החתך עם אזמל. במהלך תהליך זה, הכיוון הנכון של OSE ביחס stroma הבסיס נשמר, עם OSE encapsulating את השחלה. כפי שניתן לראות בתרשים 2, OSE של השחלות בחצי לתמצת את השחלה יותר לחלוטין לעומת השחלות לחתוך לרבעים או שמיניות. לתקן פצע של השחלותפני השטח ניתן ללמוד בהקשר של השחלה כולו עשוי לשפוך אור על איך לתקן את הביוץ פני השטח גורם לשינוי השחלות.

נקודת הסיום של הניסוי תלויה המידע הנדרש. האדריכלות רקמות, מורפולוגיה הסלולר, וספציפית שיעורי צמיחה הסלולר נמצאות תחת פיקוח בקלות באמצעות קטעים פרפין. לדוגמה, שכבה אחת של אפיתל פני השחלות הוא ציין לאחר culturing ב αMEM סרום ללא למשך 7 ימים (איור 3A) תוך תוספת של 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​אינסולין למשך 7 ימים גורם hyperproliferation של אפיתל פני השחלות היווצרות של שכבות מרובות של התאים (איור 3B). על ידי הוספת bromodeoxyuridine לתרבויות בריכוז סופי של 10 מיקרומטר 24 שעות לפני קיבעון, התרבות התאים ניתן למדוד (3A הבלעה ו 3B). עבור תרבויות נשמר αMEM בסרום חינם, כ 3-5% מכלל OSE עוברים שגשוג בתקופת 24 שעות תיוג (3A הבלעה), ואילו אחוז גבוה יותר של תאים granulosa להתרבות. תוספת של אינסולין על תרבות התקשורת מגביר את אחוז מתרבים OSE על כ -30% מסך OSE (3B הבלעה). Immunofluorescence של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ניתן דמיינו באמצעות ג'ל אלגינט עם מיקרוסקופ רגיל הבאה transfection cDNA (איור 3 ג). בעוד איבר תרבות אלגינט מספקת לצמיחה וניתוח של אפיתל פני השחלות זקיקים ראשוניים, יש לציין כי בוגרת, זקיקים משניים מצליחים לשרוד במערכת זו תרבות (איור 3D). תרבות של זקיקים בודדים לפדיון בתוך המטריצה ​​הידרוג אלגינט תוארה במקומות אחרים ^10.

שינויים חלבון או רנ"א ניתן לנתח מן האיבר כולו או סוגי תאים מסוימים באמצעות פירוק אנזימטי (איור 4). טיפול organoids השחלות תרבותי עם collagenase עוזב את stroma הבסיסית שלמים (איור 4C) תוך מתן אפשרות להעשרה של OSE בתא גלולה שהושגו לאחר הטיפול, אם כי חלק מתאי סטרומה מבודדים גם (איור 4D).

1. השחלה איור עכבר תלת ממדי התרבות המערכת השתמשו כדי להפיץ OSE לאחר פציעה. א) תחת המיקרוסקופ, בורסה לבין כרית השומן המקיפים הוסרו. ב) השחלה אינטקט (O) עם צינור oviductal (T) ושומן כרית (F). ג) השחלות עם בורסה כרית השומן הוסר (משמאל) התיר oviduct (מימין). ד) organoids השחלות או oviductal הונחו לתוך אגל אלגינט. E) organoids אלגינט עטוף הוטלו לתוך crosslinking ₂ CaCl הפתרון אלגינט כדי ליצור ג'ל. F) אלגינט במארז organoid השחלות. G) אלגינט במארז organoid oviductal. H) organoids אלגינט הגלום במדיום מודגרות תרבות.

איור 2. פני השטח מחדש על ידי השחלות לפני השטח נמדד על ידי cytokeratin 8. Encapsulation של organoids השחלות על ידי OSE לאחר וחותכים, רבעים שמיניות, ועל חצאים, בתרבית בינוני BSA, נמדד על ידי ניתוח immunohistochemical באמצעות cytokeratin 8 (CK8) נוגדן.

3. איור אלגינט מערכת התרבות מאפשר מעבר של גורמי גדילה transfection של cDNA לתוך OSE, אך אינו תומך צמיחה התבגרות מהירה של זקיקים. א) organoid השחלות בתרבית למשך 7 ימים במדיום הבסיסי ניתח עבור CK8 הביטוי, אשר מסמן את OSE. סעיף הבלעה, סידורי מוכתם עבור התאגדות BrdU. ב) תוספת של אינסולין התקשורת בתרבות גורם היפרפלזיה של OSE. סעיף הבלעה, סידורי מוכתם עבור התאגדות BrdU. ג) organoid השחלות transfected עם cDNA להביע את ה-GFP. ד) תרבות אלגינט מערכת תומכת צמיחה של זקיקים בראשיתי (חץ אדום), אבל לא משני זקיקים בשלים (חץ שחור).

איור 4. OSE ניתן לבודד לתרבות הניתוח הבא. א) Organoid בתרבית בינוני עד 2 שבועות. ב) organoid Encapsulated מטופל עם lyase אלגינט לעזוב organoid ללא פגע. השחלה היא מוכתמת CK8 לציון OSE. ג) Organoid מטופל עם collagenase אל OSE נפרד stroma הבסיסית. פיסת הרקמה נותרת היה מוכתם CK8 להדגיש הסרת פני השחלות. ד) לאחר הטיפול התאים שנאספו מועשרים עבור OSE כמו מוכתם עבור CK8 (אדום). תאים הם counterstained עם DAPI לציון גרעינים.

דיון

הפיתוח של מערכת תלת מימדי איבר תרבות ניצול הידרוג אלגינט מייצג שיטה לניתוח תכליתי הרבה סוגי רקמות שונים ממגוון רחב של אורגניזמים. השימוש תרבויות 3D ניתן להרחיב בתחומי הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית כפי שהוא מספק פיגום שעליו התאים יכולים לגדול ^11. נכון לעכשיו, במעבדה שלנו עוברת מחקרים ראשוניים באמצעות השחלות האדם רקמת החצוצרה, אך תרבות של זקיקים קוף אדם הלא אנושי תוארה ^12,13.

השימוש הידרוג אלגי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
ליבוביץ L-15 בינוני	Gibco	11415
αMEM בינוני	Gibco	12000-022
נתרן אלגינט	Novamatrix
נתרן cacodylate	סיגמא אולדריץ	C0250
רשת סיבי פוליפרופילן	מקמאסטר קאר		45 "רול רחב; 0.0041" הפתיחה
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
פניצילין / סטרפטומיצין	Gibco	15070-063
אלגינט lyase	סיגמא אולדריץ	A1603
A1603	סיגמא אולדריץ	C9697	מ Clostridium histolyticum
שור בסרום אלבומין	MP Biomedicals	103700
בסרום שור עוברית	Gibco	Gibco
ITS פתרון	רוש	11074547001	אינסולין / transferrin / נתרן סלניום
Cytokeratin 8 נוגדן	התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק	TROMA-1	השתמש ב 1:200
DAPI	וקטור Labs	H1200
Bromodeoxyuridine	סיגמא	B50002-1G	הריכוז הסופי 10 מיקרומטר