מאמר שיטה

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

DOI:

10.3791/2836

⸱

27 ביולי 2011

 , 
1Neuroscience Graduate Group, University of Pennsylvania School of Medicine , 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים מסך overexpression פלסמיד ב Saccharomyces cerevisiae, באמצעות פלסמיד ספריה ערוכים ו תפוקה גבוהה טרנספורמציה פרוטוקול שמרים עם רובוט טיפול נוזלי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נבגי שמרים, cerevisiae Saccharomyces, היא מערכת מודל עוצמה להגדרת המנגנונים הבסיסיים של תהליכים תאיים רבים חשובים, כולל אלה עם שייכות ישירה מחלות אנושיות. בגלל הזמן הקצר של הדור שלה היטב מאופיין הגנום, יתרון הניסוי העיקריים של מערכת מודל שמרים היא היכולת לבצע מסכי גנטית כדי לזהות גנים המסלולים המעורבים בתהליך נתון. במשך שלושים השנים האחרונות מסכי גנטי כזה כבר בשימוש על מנת להבהיר את מחזור התא, מסלול הפרשה, והיבטים רבים יותר שמור ביותר של ביולוגיה של התא אוקריוטים 1-5. בשנים האחרונות, ספריות genomewide מספר זני שמרים פלסמידים נוצרו 6-10. אוספים אלה מאפשרים כעת לחקירה שיטתית של תפקוד הגן באמצעות רווח, והפסד של פונקציה גישות 11-16. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לשימוש פרוטוקול תפוקה גבוהה טרנספורמציה שמרים עם רובוט טיפול הנוזל לבצע מסך overexpression פלסמיד, באמצעות ספריה ערוכים של 5500 פלסמידים שמרים. אנחנו משתמשים במסכים אלה כדי לזהות מכפילי הגנטי של רעילות הקשורות הצטברות של צבירה נוטה חלבונים אנושיים מחלות ניווניות. השיטות שהוצגו כאן הם להתאמה בקלות ללימוד פנוטיפים סלולריים אחרים בעלי עניין.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ההכנות לשינוי שמרים

פרוטוקול זה מיועד עשר צלחות 96-טוב אבל יכול להיות scaled למעלה או למטה בהתאם. מצאנו כי פרוטוקול זה לא עובד טוב יותר מעשרים 96-היטב צלחות בכל סבב של טרנספורמציה. הליך השינוי כולו (משלב I.3) ייקח בערך שמונה שעות.

  1. Aliquot 5-10μL של DNA פלסמיד (100 ng / μl) מן הספרייה שמרים ORF FLEXGene לתוך הבאר התחתון של כל עיגול 96-גם צלחת עם המטפל RapidPlate Biorobot נוזלי. המקום חשפו צלחות 96-היטב מכסה המנוע ספסל נקי קטר לילה יבש. מצאנו יעילות טרנספורמציה דומה עם ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבצע המסך תפוקה גבוהה overexpression פלסמיד בשמרים. גישה זו מאפשרת להקרנה מהירה משוחדת עבור מכפילי הגנטי של פנוטיפים רבים סלולריים שונים. שימוש בגישה זו, חוקר יכול המסך חלק ניכר של הגנום שמרים ב עניין של שבועות. גישה זו משוחדת גם מאפשר זיהוי של מכפילי, אשר לא יכול היה לנבא מבוסס על ממצאים קודמים. השתמשנו בגישה זו כדי לזהות מכפילי של רעילות הקשורות אגרגציה של חלבונים אנושיים למחלות ניווניות 19,21-23. עם זאת, בשל כושר ההסתגלות של פרוטוקול זה ללמוד .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המרכז Packard עבור ALS מחקר באוניברסיטת ג'ונס הופקינס (ADG), פרס ממציא ניו מנהל NIH 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), אלן ריטה פרס קרן Scholar. ADG הוא חוקר Pew במדעי ביו, נתמך על ידי Pew Charitable Trusts.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב חברה מספר קטלוגי
BioRobot RapidPlate Qiagen 9000490
96 הבריח משכפל (Frogger) V & P מדעי VP404
FLEXGene ORF הספריה המכון Proteomics, מבית הספר לרפואה הארוורד
Tabletop צנטריפוגות Eppendorf 5810R
בקבוק מבולבל 500ml Bellco 2543-00500
2.8L משולשת מבולבל Fernbach צפחת Bellco 2551-02800
100μL Rapidplate פיפטה טיפים Axygen ZT-100-RS
200μL Rapidplate פיפטה טיפים Axygen ZT-200-RS

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nurse, P. The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens. EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).
  2. Hartwell, L. H. Nobel Lecture. Yeast and cancer. Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).
  3. Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Yeast Plasmid ScreenHigh Throughput TransformationSaccharomyces CerevisiaePlasmid OverexpressionGenetic ScreensLiquid Handling RobotSpotting AssayAggregation Prone ProteinsGene Function Analysis96 Well Plates

מאמרים קשורים