מאמר שיטה

כלי עריכת בסיס בתיווך קריספר: טכניקת עריכת גנום לזירוז החלפת בסיס ממוקדת

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: ראה, J. E., et al. הערכה תפקודית של גרסאות BRCA1 באמצעות עורכי בסיס בתיווך קריספר. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מסביר את הרעיון של עורכי בסיס ציטוזין בתיווך קריספר לגרימת החלפת נוקלאוטידים ממוקדת.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. יצירת גרסאות BRCA1 באמצעות כלי עריכה בסיסיים בתיווך קריספר

הערה: אם לא נעשה שימוש בקווי תאים HAP1-BE3, DNA פלסמיד מקודד BE3 יכול להיות נגוע יחד עם gRNA ממוקד BRCA1. בהשוואה לטרנספקציה משותפת של פלסמידים BE3 ו-gRNA, טרנספקציה של פלסמיד gRNA לתאי HAP-BE3 גורמת לעריכת בסיס יעילה עד פי 3 במיקום המטרה בידינו.

  1. זרע 5 x 105 תאי HAP1-BE3 (או תאי HAP1 במקרה של שיטות טרנספקציה משותפת) לכל באר בצלחות 24 בארות יום אחד לפני הטרנספקציה. בזמן הטרנספקציה, תאי תרבית להגיע לצפיפות מתאימה (70%-80% מפגש).
  2. Transfect BRCA1-targeting gRNA באמצעות ריאגנטים transfection שנרכשו (טבלה של חומרים) על פי פרוטוקול היצרן. השתמש ב-1 מיקרוגרם של gRNA ממוקד BRCA1 (עם 1 מיקרוגרם של DNA פלסמיד מקודד BE3 במקרה של שיטות טרנספקציה משותפת) כדי לגרום להמרת C:G ל-T:A באתרי היעד של BRCA1. לדגור על התאים ב 37 ° C ותת-תרבית כל 3-4 ימים.
  3. קצרו את כדורי התא 3, 10 ו-24 ימים לאחר הטרנספקציה כדי לנתח את יעילות עריכת הבסיס (דגימות מ-3 ימים לאחר הטרנספקציה מנותחות מחדש כדגימות יום 0).
  4. חילוץ DNA גנומי באמצעות ערכת טיהור DNA גנומי (Table of Materials).
    הערה: אנו ממליצים למטב את תנאי הטרנספקציה עם יחס משתנה בין מגיב לדנ"א. המצב האופטימלי להתמרה HAP1 הוא מנת מגיב 4:1 לדנ"א בידינו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ליפופקטמין 2000 תרמו פישר סיינטיפיק 11668027מגיב טרנספקציה
Opti-MEM גיבקו 31985070חומרי טרנספקציה
מגיב טרנספקציה HD FuGENE פרומגה E2311 מגיב טרנספקציה
המדיום של איסקוב שונה של דולבקו גיבקו 12440046בינוני עבור תאי HAP1
lentiCas9-פיצוץ אדג'ין 52962דנ"א פלסמידים לשיבוט lentiBE3
ערכת דם ורקמות DNeasyקיאגן69504ערכת הכנת DNA גנומי

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CRISPRTargeting BRCA1RNADNAHAP1 BE3Cas9

מאמרים קשורים