כלי עריכת בסיס בתיווך קריספר: טכניקת עריכת גנום לזירוז החלפת בסיס ממוקדת

1. יצירת גרסאות BRCA1 באמצעות כלי עריכה בסיסיים בתיווך קריספר

הערה: אם לא נעשה שימוש בקווי תאים HAP1-BE3, DNA פלסמיד מקודד BE3 יכול להיות נגוע יחד עם gRNA ממוקד BRCA1. בהשוואה לטרנספקציה משותפת של פלסמידים BE3 ו-gRNA, טרנספקציה של פלסמיד gRNA לתאי HAP-BE3 גורמת לעריכת בסיס יעילה עד פי 3 במיקום המטרה בידינו.

1. זרע 5 x 10⁵ תאי HAP1-BE3 (או תאי HAP1 במקרה של שיטות טרנספקציה משותפת) לכל באר בצלחות 24 בארות יום אחד לפני הטרנספקציה. בזמן הטרנספקציה, תאי תרבית להגיע לצפיפות מתאימה (70%-80% מפגש).
2. Transfect BRCA1-targeting gRNA באמצעות ריאגנטים transfection שנרכשו (טבלה של חומרים) על פי פרוטוקול היצרן. השתמש ב-1 מיקרוגרם של gRNA ממוקד BRCA1 (עם 1 מיקרוגרם של DNA פלסמיד מקודד BE3 במקרה של שיטות טרנספקציה משותפת) כדי לגרום להמרת C:G ל-T:A באתרי היעד של BRCA1. לדגור על התאים ב 37 ° C ותת-תרבית כל 3-4 ימים.
3. קצרו את כדורי התא 3, 10 ו-24 ימים לאחר הטרנספקציה כדי לנתח את יעילות עריכת הבסיס (דגימות מ-3 ימים לאחר הטרנספקציה מנותחות מחדש כדגימות יום 0).
4. חילוץ DNA גנומי באמצעות ערכת טיהור DNA גנומי (Table of Materials).
   הערה: אנו ממליצים למטב את תנאי הטרנספקציה עם יחס משתנה בין מגיב לדנ"א. המצב האופטימלי להתמרה HAP1 הוא מנת מגיב 4:1 לדנ"א בידינו.