כלי עריכת בסיס בתיווך קריספר: טכניקת עריכת גנום לזירוז החלפת בסיס ממוקדת

תקציר

מקור: ראה, J. E., et al. הערכה תפקודית של גרסאות BRCA1 באמצעות עורכי בסיס בתיווך קריספר. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מסביר את הרעיון של עורכי בסיס ציטוזין בתיווך קריספר לגרימת החלפת נוקלאוטידים ממוקדת.

פרוטוקול

1. יצירת גרסאות BRCA1 באמצעות כלי עריכה בסיסיים בתיווך קריספר

הערה: אם לא נעשה שימוש בקווי תאים HAP1-BE3, DNA פלסמיד מקודד BE3 יכול להיות נגוע יחד עם gRNA ממוקד BRCA1. בהשוואה לטרנספקציה משותפת של פלסמידים BE3 ו-gRNA, טרנספקציה של פלסמיד gRNA לתאי HAP-BE3 גורמת לעריכת בסיס יעילה עד פי 3 במיקום המטרה בידינו.

1. זרע 5 x 10⁵ תאי HAP1-BE3 (או תאי HAP1 במקרה של שיטות טרנספקציה משותפת) לכל באר בצלחות 24 בארות יום אחד לפני הטרנספקציה. בזמן הטרנספקציה, תאי תרבית להגיע לצפיפות מתאימה (70%-80% מפגש).
2. Transfect BRCA1-targeting gRNA באמצעות ריאגנטים transfection שנרכשו (טבלה של חומרים) על פי פרוטוקול היצרן. השתמש ב-1 מיקרוגרם של gRNA ממוקד BRCA1 (עם 1 מיקרוגרם של DNA פלסמיד מקודד BE3 במקרה של שיטות טרנספקציה משותפת) כדי לגרום להמרת C:G ל-T:A באתרי היעד של BRCA1. לדגור על התאים ב 37 ° C ותת-תרבית כל 3-4 ימים.
3. קצרו את כדורי התא 3, 10 ו-24 ימים לאחר הטרנספקציה כדי לנתח את יעילות עריכת הבסיס (דגימות מ-3 ימים לאחר הטרנספקציה מנותחות מחדש כדגימות יום 0).
4. חילוץ DNA גנומי באמצעות ערכת טיהור DNA גנומי (Table of Materials).
   הערה: אנו ממליצים למטב את תנאי הטרנספקציה עם יחס משתנה בין מגיב לדנ"א. המצב האופטימלי להתמרה HAP1 הוא מנת מגיב 4:1 לדנ"א בידינו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ליפופקטמין 2000	תרמו פישר סיינטיפיק	11668027	מגיב טרנספקציה
Opti-MEM	גיבקו	31985070	חומרי טרנספקציה
מגיב טרנספקציה HD FuGENE	פרומגה	E2311	מגיב טרנספקציה
המדיום של איסקוב שונה של דולבקו	גיבקו	12440046	בינוני עבור תאי HAP1
lentiCas9-פיצוץ	אדג'ין	52962	דנ"א פלסמידים לשיבוט lentiBE3
ערכת דם ורקמות DNeasy	קיאגן	69504	ערכת הכנת DNA גנומי