בידוד מונוציטים מדם שלם על ידי ברירה שלילית אימונומגנטית

תקציר

מקור: Plaisance-Bonstaff, K., et al. בידוד, טרנספקציה ותרבות של מונוציטים אנושיים ראשוניים. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה אנו מדגימים בידוד של מונוציטים מדם אנושי שלם על ידי הפרדה אימונומגנטית שלילית. המונוציטים המבודדים יכולים לשמש לניתוח נוסף במורד הזרם.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. בידוד מונוציטים אנושיים ראשוניים על ידי ברירה שלילית אימונומגנטית

1. לאסוף 40 מ"ל של דם מלא אנושי טרי (מחולה ^HIV+ או מקבוצת ביקורת בריאה) בארבע שפופרות ואקום של 10 מ"ל חומצה אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA) (10 מ"ל דם לכל צינור). באמצעות טכניקות סטריליות תחת ארון בטיחות ביולוגית, להעביר את כל 40 מ"ל של דם לתוך צינור אחד 50 מ"ל פרופילן חרוטי.
2. בהתאם לפרוטוקול היצרן עבור ערכת בידוד המונוציטים האנושית שנבחרה (טבלה של חומרים), יש להוסיף 2 מ"ל של קוקטייל בידוד מונוציטים, המסופק בערכה, לצינור הדם. מערבולת חרוזים מגנטיים, מסופק גם בערכה, במשך 30 שניות, ולהוסיף 2 מ"ל צינור הדם.
   1. אם פחות מ 40 מ"ל של דם זמין, להקטין את ריאגנטים הוסיף. כדי לערבב את התמיסה, פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה סרולוגית פלסטיק 25 מ"ל ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
3. יש להפריד את תערובת הדם באופן שווה לארבע צינוריות של 50 מ"ל ולהוסיף 30 מ"ל של מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) המכיל 1 mM EDTA לכל צינור. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה סרולוגית פלסטיק 25 מ"ל.
4. הניחו את הצינורות במחזיקי מגנטים למשך 10 דקות כדי להסיר את החרוזים המגנטיים המצומדים באמצעות נוגדנים. השתמשו בארבעה מחזיקי מגנטים בו זמנית, אחד לכל צינור, כדי לאפשר זמני דגירה ובידוד עקביים לכל דגימת דם.
5. ציירו את התכולה ממרכז כל צינור, באמצעות פיפטה, כשהם עדיין במחזיקי המגנט. היזהר לא לצייר תאי דם אדומים (לא יותר מ -10% מהנפח ההתחלתי של 10 מ"ל), והכנס את התוכן לאחד מארבעה צינורות חדשים של 50 מ"ל.
6. הוסף 500 μL של חרוזים מגנטיים מערבלים לכל צינור 50 מ"ל. פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה 25 מ"ל ולדגור ב RT במשך 5 דקות. לאחר מכן, הכניסו את הצינורות למחזיקי מגנטים למשך 5 דקות.
7. העבירו בזהירות את התכולה ממרכז כל צינור בעודכם במחזיקי מגנטים לאחד מארבעה צינורות חדשים של 50 מ"ל. הניחו ישירות כל צינור חדש בנפח 50 מ"ל במחזיקי המגנט למשך 5 דקות.
8. העבר בזהירות את התוכן ממרכז כל צינור לאחד מארבעה צינורות חדשים של 50 מ"ל. סובב את כל צינורות 50 מ"ל החדשים ב 300 x גרם במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כל ארבעת כדורי התא בסך הכל 10 מ"ל של PBS סטרילי.
9. ספירת תאים על ידי הרחקת כחול טריפאן באמצעות hemocytometer.
   הערה: 8-20 x 10⁶ תאים מתקבלים בדרך כלל מ 40 מ"ל של דם שלם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.5 מיליון EDTA	Invitrogen	AM9260G
צינורות איסוף דם פלסטיק BD Vacutainer עם K2EDTA	BD Biosciences	366643
מגנט Easy 50 EasySep	טכנולוגיות StemCell	18002
ערכת בידוד מונוציטים אנושית ישירה Easy Sep	טכנולוגיות StemCell	19669
PBS	גיבקו	20012027
RPMI 1640 עם L-גלוטמין	קורנינג	10040CVMP