כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. בידוד מונוציטים אנושיים ראשוניים על ידי ברירה שלילית אימונומגנטית
- לאסוף 40 מ"ל של דם מלא אנושי טרי (מחולה HIV+ או מקבוצת ביקורת בריאה) בארבע שפופרות ואקום של 10 מ"ל חומצה אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA) (10 מ"ל דם לכל צינור). באמצעות טכניקות סטריליות תחת ארון בטיחות ביולוגית, להעביר את כל 40 מ"ל של דם לתוך צינור אחד 50 מ"ל פרופילן חרוטי.
- בהתאם לפרוטוקול היצרן עבור ערכת בידוד המונוציטים האנושית שנבחרה (טבלה של חומרים), יש להוסיף 2 מ"ל של קוקטייל בידוד מונוציטים, המסופק בערכה, לצינור הדם. מערבולת חרוזים מגנטיים, מסופק גם בערכה, במשך 30 שניות, ולהוסיף 2 מ"ל צינור הדם.
- אם פחות מ 40 מ"ל של דם זמין, להקטין את ריאגנטים הוסיף. כדי לערבב את התמיסה, פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה סרולוגית פלסטיק 25 מ"ל ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- יש להפריד את תערובת הדם באופן שווה לארבע צינוריות של 50 מ"ל ולהוסיף 30 מ"ל של מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) המכיל 1 mM EDTA לכל צינור. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה סרולוגית פלסטיק 25 מ"ל.
- הניחו את הצינורות במחזיקי מגנטים למשך 10 דקות כדי להסיר את החרוזים המגנטיים המצומדים באמצעות נוגדנים. השתמשו בארבעה מחזיקי מגנטים בו זמנית, אחד לכל צינור, כדי לאפשר זמני דגירה ובידוד עקביים לכל דגימת דם.
- ציירו את התכולה ממרכז כל צינור, באמצעות פיפטה, כשהם עדיין במחזיקי המגנט. היזהר לא לצייר תאי דם אדומים (לא יותר מ -10% מהנפח ההתחלתי של 10 מ"ל), והכנס את התוכן לאחד מארבעה צינורות חדשים של 50 מ"ל.
- הוסף 500 μL של חרוזים מגנטיים מערבלים לכל צינור 50 מ"ל. פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה 25 מ"ל ולדגור ב RT במשך 5 דקות. לאחר מכן, הכניסו את הצינורות למחזיקי מגנטים למשך 5 דקות.
- העבירו בזהירות את התכולה ממרכז כל צינור בעודכם במחזיקי מגנטים לאחד מארבעה צינורות חדשים של 50 מ"ל. הניחו ישירות כל צינור חדש בנפח 50 מ"ל במחזיקי המגנט למשך 5 דקות.
- העבר בזהירות את התוכן ממרכז כל צינור לאחד מארבעה צינורות חדשים של 50 מ"ל. סובב את כל צינורות 50 מ"ל החדשים ב 300 x גרם במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כל ארבעת כדורי התא בסך הכל 10 מ"ל של PBS סטרילי.
- ספירת תאים על ידי הרחקת כחול טריפאן באמצעות hemocytometer.
הערה: 8-20 x 106 תאים מתקבלים בדרך כלל מ 40 מ"ל של דם שלם.
2. גידול מונוציטים אנושיים ראשוניים
- באמצעות אמבט מים בטמפרטורה של 37°C, מדיית RPMI 1640 חמה ללא סרום בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין (עט/סטרפטוקופס), ותוך כדי המשך שימוש בטכניקות סטריליות תחת ארון בטיחות ביולוגית, יש להשהות מחדש את המונוציטים המבודדים במדיה זו בריכוז של 1 x 106 תאים/מ"ל.
- הוסף 1 מ"ל של תאים מרחפים לכל באר של צלחת 6 בארות או לתוך צלחת 35 מ"מ (מספר התאים הסופי צריך להיות 1 x 106 תאים / צלחת), ומניחים באינקובטור 37 ° C עם 5% CO2. המתן 0.5-1.0 שעות עד שהתאים יצמדו.
- שימוש באמבט מים בטמפרטורה של 37°C, סרום בקר עוברי (FBS) מומת חום חם (HI). הוסף 100 μL (ריכוז סופי של 10%) של FBS לכל צלחת. הוסיפו גורמי גדילה לתאים כדי לקדם התמיינות מקרופאגים.
- מקרופאגים ראשוניים לפנוטיפ דמוי M1 על ידי הוספת 25 ננוגרם/מ"ל של גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) למדיה. מקרופאגים ראשוניים לפנוטיפ דמוי M2 על ידי הוספת 50 ng/mL של גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF) ל- media.
הערה: הן GM-CSF והן M-CSF מאפשרים התמיינות מונוציטים לפנוטיפ מקרופאגים כללי (M0) תוך הכנת תאים עבור M1 או M2, בהתאמה.
