כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. PMC בידוד וטיפוח על ידי שטיפה intraperitoneal
- בידוד PMC על ידי שטיפה intraperitoneal
- לפני בידוד התא, הכינו את החומרים המפורטים בטבלה 1.
- השתמשו בעכברים זכרים בני 8 עד 14 שבועות לבידוד PMC. הרדימו עכבר על ידי שאיפתCO2, ואשרו את המוות על ידי אובדן רפלקסים. רססו את העכבר באתנול 70% וקיבעו אותו על גוש קצף באמצעות פינים (הצד הגבי כלפי מטה). הסר את העור הגחוני של העכבר באמצעות מספריים קהים. הימנע מפגיעה בחלל הצפק.
הערה: אנו משתמשים בדרך כלל בפרוטוקול זה עבור עכברים עם רקע גנטי של זן C57BL/6N.
- להזריק 7 מ"ל של מדיום סל"ד קר כקרח ו 5 מ"ל של אוויר בחלל הצפק באמצעות מזרק 10 מ"ל מצויד מחט 27 גרם. לדחוף את המחט בזהירות בצפק ולא לנקב שום איברים. השתמש נקודה באזור של שומן epididymal כדי להפחית את הסיכון של ניקוב איברים.
- לאחר ההזרקה, נערו את העכבר למשך דקה אחת כדי לנתק את תאי הצפק למדיום הסל"ד. אין לנער את העכבר חזק מדי, כדי למנוע פגיעה באיברים הפנימיים וזיהום חלל הצפק בדם.
- עשו שימוש חוזר במזרק 10 מ"ל על ידי הצטיידותו בצינורית 20 G חדשה. הזיזו את האיברים הפנימיים לצד אחד על ידי הטיית גוש הקצף וטפיחה עדינה על הספסל כדי להקל על השאיפה הבינונית מהצד השני. הכנס מחט 20 גרם, שיקוע כלפי מעלה, ושאפו את הנוזל מהבטן בעדינות ובאיטיות (~ 0.5 מ"ל לשנייה) כדי למנוע סתימה על ידי האיברים הפנימיים. לאסוף כמה שיותר נוזלים (בדרך כלל 5-6 מ"ל).
- הסר את המחט מהמזרק והעבר את תרחיף התאים שנאסף לצינור איסוף על קרח. יש להשליך צינורית דגימה אם קיים זיהום דם גלוי.
- צנטריפוגה את הצינורות עם תרחיף התא ב ~ 300 x גרם במשך 5 דקות. מתחת למכסה מנוע סטרילי שואפים הסופר-נטנט. עבור כל עכבר, לשלב את כדורי הדגימה ב 4 מ"ל של קר (4-10 ° C) PMC בינוני ולהעביר את תרחיף התא 25ס"מ 2 צלוחיות תרבית. הוסף את גורמי הגדילה IL-3 ו- SCF לריכוזים הסופיים של 10 ננוגרם/מ"ל ו- 30 ננוגרם/מ"ל, בהתאמה. מניחים את הבקבוק המכיל את התאים באינקובטור (37 מעלות צלזיוס ו -5% CO2) ודגרים במשך ~ 48 שעות עד להליך הבא.
- תרבות PMC
- יום 2 (~ 48 שעות לאחר הבידוד): שינוי בינוני
- כדי להסיר את התאים הסופרנאטנטיים והלא דבקים (אריתרוציטים ותאים מתים), שאפו את המדיום מהבקבוק על ידי הנחת קצה פיפטה של פסטר בקצה הבקבוק והחזקת הבקבוק כמעט אופקית. הוסף 4 מ"ל של PMC Medium שחומם מראש לכל עכבר. הוסף את גורמי הצמיחה IL-3 (10 ננוגרם/מ"ל) ו-SCF (30 ננוגרם/מ"ל). מניחים את הבקבוק המכיל את התאים באינקובטור (37 מעלות צלזיוס ו -5% CO2).
- יום 9: פיצול תאים
- מעבירים את תרחיף התא מבקבוק תרבית התא לתוך צינור צנטריפוגת פלסטיק בנפח 50 מ"ל. שטפו את הבקבוק שלוש פעמים עם 10 מ"ל מחומם מראש (37°C) של Dulbecco's פוספט-buffered מלוחים (DPBS), איסוף תרחיף התא עם התאים מנותקים באותו צינור צנטריפוגה פלסטיק 50 מ"ל. לספור את ריכוז התא על ידי hemocytometer, ולחשב את המספר הכולל של תאים.
- צנטריפוגה את מתלה התא ב~ 300 x גרם למשך 5 דקות ושאפו את הסופרנטנט. לשחזר את הגלולה ב PMC מחומם מראש בינוני (37 ° C) כדי לקבל את ריכוז התא 1 x 106 תאים / מ"ל. מעבירים את תרחיף התא לצלוחית תרביתחדשה בגודל 25 ס"מ. השליכו את הבקבוק הישן עם פיברובלסטים הנצמדים לתחתית.
- הוסף את גורמי הגדילה IL-3 (10 ננוגרם/מ"ל) ו-SCF (30 ננוגרם/מ"ל), ומקם את הבקבוק המכיל את התאים באינקובטור (37°C ו-5% CO2).
- ימים 12–15: מדידות תאים
- אם מתוכננים ניסויים כלשהם עם גירוי של קולטני FcɛRI, טפלו בתאים במשך הלילה עם 300 ננוגרם/מ"ל של IgE anti-DNP במדיום תרבית סטנדרטי.
2. מדידת שחרור בטא-הקסוסמינידז ב-PMC
- לפני המדידות, הכינו את החומרים המפורטים בטבלה 2.
הערה: β-הקסוזמינידז משתחרר מMCs לאחר הגירוי שלהם הידרוליזה p-nitrophenyl-acetyl-D-glucosamine (pNAG) לתוך p-nitrophenol ו-N-אצטיל-D-glucosamine. כמות β-hexosaminidase במדגם פרופורציונלית לכמות p-nitrophenol שייווצר. בסביבת pH גבוהה של "Stop Solution", p-nitrophenol קיים כ-p-nitrophenolat שעבר פירוק מלא וניתן לזהותו על ידי ספיגת האור שלו ב-405 ננומטר.
- הכינו את התמיסה של Tyrode המכילה 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.4 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5.6 mM גלוקוז ו-BSA 0.1%. כוונן את ה- pH ל- 7.4 עם 3 M NaOH.
- הכן את תמיסת הליזיס על ידי הוספת נפח של 1% של Triton X-100 לתמיסת Tyrode.
- הכינו את תמיסת העצירה המורכבת מגליצין של 200 מילימטר וכווננו את ה- pH ל- 10.7 עם NaOH.
- הכן את תמיסת pNAG (4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) על ידי המסת pNAG בחומצת לימון 0.4M לריכוז סופי של 4 mM.
- חשב את כמות התאים הדרושים לבדיקה (בצע את הבדיקה בכפילות). השתמש ב- 200,000 PMC לכל באר. השתמש ב-2 בארות כבקרות שליליות (הפתרון של Tyrode ללא כל הפרשה כגון DNP או תרכובת 48/80) וב-2 בארות כבקרות חיוביות (הפתרון של Tyrode עם 10 μM Ionomycin) עבור כל גנוטיפ.
- מעבירים את התאים לצינור צנטריפוגת פלסטיק של 15 מ"ל, מכוונים את הנפח ל-15 מ"ל עם התמיסה של טירודה, וצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 4 דקות. מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטת פסטר ומשהים מחדש את התאים בתמיסה של טירודה ל-2 x 106 תאים/מ"ל.
- העבר 100 μL של תרחיף התא לכל באר לצלחת באר V-bottom 96 באר. הוסיפו 25 מיקרוליטר של תמיסת גירוי או בקרה לכל באר (בהתאם לסכמת הצנרת המתוארת באיור 1A). לדגור על התאים במשך 45 דקות ב 37 ° C ו 5% CO2.
- עצור את התגובה על ידי הנחת צלחת 96 בארות על קרח במשך 5 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצלחת ב 4 ° C במשך 4 דקות ב 120 x גרם. מעבירים 120 μL של הסופרנאטנט באמצעות פיפטה רב ערוצית לצלחת שטוחה בעלת 96 בארות ומניחים אותה על קרח. בזהירות להימנע מלגעת בכדורי התא, אבל לגמרי לשאוף את supernatant.
- הוסף 125 μL של חיץ ליזיס לכדורי התא. דוגרים על כדורי התא במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ומשעימים אותם מחדש לאחר הדגירה על ידי פיפטינג חוזר (כ-5 פעמים).
- פיפטה 25 μL של תמיסת pNAG (4 mM) בבארות הנדרשות של צלחת חדשה בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות. יש להוסיף 25 μL מכל סופרנאטנט לתמיסת pNAG המוכנה, כמו גם 25 μL של כל תא ליזט.
- לדגור את אצוות התגובה במשך 1 שעה ב 37 ° C. לאחר הדגירה, פיפטה 150 μL של תמיסת עצירה לכל באר כדי לעצור את התגובה.
- נתח את הלוח באמצעות קורא מיקרו-לוחות באמצעות הגדרת אורך גל כפול של 405 ננומטר עם סימוכין של 630 ננומטר לחיסור רקע אוטומטי. בתוכנית הרכישה, סמן את התיבה "הפניה" ובתפריט רכיב התוכנית "קליטה", בחר "630 ננומטר" מהרשימה הנפתחת. אם הצפיפות האופטית של הדגימות גבוהה מדי, הכינו דילול מתאים של הבדיקה לפני מדידה מחדש.
טבלה 1: חומרים לשלב 1.
| 1 | קרח |
| 2 | מזרקים 10 מ"ל |
| 3 | 27 גר' מחטים |
| 4 | 20 גר' מחטים |
| 5 | בלוק קלקר וסיכות |
| 6 | צינורות איסוף (50 מ"ל צינורות צנטריפוגות פלסטיק) |
| 7 | 70% אתנול |
| 8 | RPMI בינוני (מקורר מראש ונשמר על קרח) |
| 9 | PMC בינוני: RPMI בינוני + 20% FCS (סרום עגל עובר) + 1% תמיסת סטרפטומיצין פניצילין (Pen-Strep) |
| 10 | מלח חוצץ פוספט של Dulbecco - DPBS (ללא Ca2+ ו- Mg2+) |
| 11 | צלוחיות תרבות (25 ס"מ) |
| 12 | פתרונות מלאי גורמי צמיחה (IL-3: 1 מיקרוגרם/μL; SCF: 2.5 מיקרוגרם/מ"ל) |
| 13 | פיפטות סרולוגיות (10 מ"ל) |
| 14 | פיפטות קצוות סטריליים (20-200 μL) |
| 15 | המוציטומטר |
| 16 | צנטריפוגת ספסל |
| 17 | מספריים ומלקחיים |
| 18 | תא CO2 לעכברים |
| 19 | מכסה מנוע סטרילי פתוח |
| 20 | מכסה מנוע סטרילי סגור |
| 21 | אינקובטור תאים (37°C ו-5% CO2) |
| 22 | פיפטות העברה (20–200 μL) |
טבלה 2: חומרים לשלב 2.
| 1 | PMC (בן 12-15 ימים) 1 x 106 תאים/מ"ל |
| 2 | פתרון מלאי נוגדנים נגד DNP (IgE) |
| 3 | פתרון מניות DNP-HSA |
| 4 | פתרון מלאי מורכב 48/80 |
| 5 | יונומיצין |
| 6 | צלחת 96 באר, תחתית בצורת V |
| 7 | 96-באר צלחות, תחתית שטוחה |
| 8 | צינורות צנטריפוגות פלסטיק (15 מ"ל) |
| 9 | פיפטות סרולוגיות |
| 10 | אינקובטור תאים (37°C ו-5% CO2) |
| 11 | צנטריפוגת ספסל |
| 12 | קורא לוחות Microtiter למדידות צפיפות אופטית |
| 13 | פיפטה רב ערוצית (20–200 מיקרוליטר) |
| 14 | המוציטומטר |
