בידוד ותרבית של תאי קופפר עכבר

תקציר

מקור: Bourgognon, M., et al. Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (2015)

בסרטון זה אנו מדגימים את הבידוד של תאי קופפר או מקרופאגים בכבד מהכבד של העכבר. הכבד מחורר בתמיסת עיכול ואחריה הפרדה הדרגתית של צפיפות. תאי קופפר הדבקים המבודדים יכולים לשמש לניתוח נוסף.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. זילוח ואיסוף תאים (איור 1)

1. להכין טרי את כל ריאגנטים המתוארים בטבלת החומר.
2. חממו את תמיסת EGTA (אתילן גליקול חומצה טטרה-אצטית)/HBSS (תמיסת מלח מאוזנת של Hank) (50 מ"ל לעכבר) ואת תמיסת Collagenase (100 מ"ל לעכבר) למשך 30 דקות ב-40°C.
3. שטפו תחילה את הצינורית הגמישה של המשאבה באתנול 70%. יש לשפוך 40 מ"ל של תמיסת EGTA/HBSS לתוך צינור צנטריפוגה השקוע באמבט המים ולשטוף את הצינור הגמיש של המשאבה בתמיסת EGTA/HBSS שחוממה מראש.
4. בצע הרדמה סופנית באמצעות barbiturate כדי לייצר באופן אמין חוסר הכרה לפני דיכאון נשימתי ומוות. הזריקו פנוברביטון במינון של 1 מ"ג/ק"ג, כלומר לעכבר CD1 נקבה או זכר (35-45 גרם). אשר את ההרדמה על ידי צביטת בוהן.
5. יש לגלח את שערות הבטן ולעקר את משטח הבטן באמצעות תמיסת אתנול 70%.
6. חותכים דרך חלל הבטן וחושפים את וריד הפורטל ואת הווריד הנבוב התחתון על ידי הזזת המעי לרוחב משמאל לבטן.
7. הפעילו את המשאבה במהירות של 1-3 מ"ל/דקה עם תמיסת EGTA/HBSS וקשרו את וריד הפורטל באמצעות מחט פרפר 23 גרם (כנפיים חתוכות). מהדקים את החלק של וריד הפורטל עם מחט 23 G ולאחר מכן להפוך את המלקחיים serrefine על פני השטח של בטן העכבר פתוח. הכבד אמור להחוויר במהירות בתוך 30 השניות הראשונות של זילוח תמיסת EGTA/HBSS.
8. חתכו במהירות את החלק התחתון של הווריד קאווה התחתון כדי למנוע הצטברות לחץ עודף בכבד, ולאחר מכן הגבירו את קצב הזרימה בהדרגה ל-7 מ"ל/דקה, במהלך הדקה הראשונה של הזילוח. החיה מתה עקב דימום משני לנקב הוורידים.
9. כאשר פחות מ-5 מ"ל של תמיסת EGTA/HBSS נשארת בצינור הצנטריפוגה, מלא אותה בתמיסת Collagenase (40-50 מ"ל). הגדילו את קצב הזרימה בהדרגה ל-10 מ"ל/דקה, מעל 30 שניות.
10. הפוך את הכבד להתנפח על ידי הפעלת לחץ על הווריד נבוב נחות, באמצעות פינצטה, במשך 5-10 שניות מרווחים. זה יכול להיעשות מעת לעת (5-10 פעמים במהלך העיכול). שלב זה ישפר את הדיסוציאציה של תאי הכבד ויפחית את זמן הזילוח עם collagenase.
11. כאשר פחות מ -10 מ"ל של תמיסת Collagenase נשאר בתוך צינור הצנטריפוגה, לשפוך 40-50 מ"ל של תמיסת Collagenase שחוממה מראש לתוך צינור הצנטריפוגה.
12. לאחר 10-15 דקות של זילוח וכ 70-80 מ"ל של פתרון Collagenase מחורר, להפעיל לחץ קטן על פני השטח של הכבד עם מלקחיים. הדפסה של הלחץ מצביעה על כך שתאי הכבד מנותקים.
13. מוציאים את הכבד מחלל הבטן בחתיכה אחת ומניחים אותו בצינור צנטריפוגה המכיל 20-30 מ"ל של מדיום בידוד תאי קופפר. שמור על תאי הכבד על קרח או ב 4 ° C לתקופה מקסימלית של 3 שעות כדי למנוע השפעה על הכדאיות תאי הכבד.
14. חזור על הליך הזילוח על מספר בעלי חיים במידת הצורך, תוך שמירה על הכבד המחורר על קרח. אגרו אחד עד שלושה כבדים לטיהור והמשיכו לשלב 3.

2. הכנת שיפוע הצפיפות לצנטריפוגה (איור 2)

1. המשך בשלבים הבאים (סעיפים 2, 3 ו -5) בתנאים סטריליים ושמור תאים על קרח או ב -4 מעלות צלזיוס. הכן את SIP (תמיסה של חלקיקי סיליקה מצופים איזוטוניים) על ידי ערבוב 15.3 מ"ל של תמיסת חלקיקי סיליקה מצופים עם 1.7 מ"ל של 10 x PBS.
2. כדי ליצור 20 מ"ל של 25% תמיסת SIP, ערבבו 5 מ"ל של SIP עם 15 מ"ל של PBS. כדי ליצור 20 מ"ל של תמיסת 50% SIP, ערבבו 10 מ"ל של SIP עם 10 מ"ל של PBS.
3. מלא צינור צנטריפוגה אחד עם 20 מ"ל של תמיסת 50% SIP. הטה את צינור הצנטריפוגה בזווית הקרובה ל-90° והוסף באיטיות את תמיסת ה-SIP 25% (20 מ"ל) על הדופן הצדדית של הצינור באמצעות פיפטה סרולוגית של 25 מ"ל, מבלי לגעת בפני השטח של שכבת 50% SIP. בעת הוספת תמיסת SIP של 25%, צמצם בהדרגה את זווית הצינור. שמרו את שיפוע הצפיפות על קרח עד לשימוש.

3. טיהור תאי קופפר (איור 3)

1. שים כבד אחד מחורר בצלחת פטרי עם 15 מ"ל של Kupffer Cell Isolation Medium. קורעים את קפסולת הגליסון (קרום הכבד) באמצעות מספריים ומשחררים את כל תאי הכבד למדיום בידוד תאי קופפר. סנן את התמיסה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר שתיאסף בצינור צנטריפוגה. חזור על הליך הזילוח על כבדים מחוררים נוספים ואיחד את התאים באותו צינור צנטריפוגה (15 מ"ל מעכבר אחד, ועד 45 מ"ל משלושה עכברים).
2. צנטריפוגה תרחיף התא ב 50 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C. תאים פרנכימליים (hepatocytes) יהיו בכדורית ותאים שאינם parenchymal (כולל תאי Kupffer) יהיה supernatant.
3. אספו את הסופרנאטנט בצינור צנטריפוגה נקי ובצנטריפוגה במהירות של 50 x גרם למשך 2 דקות כל אחת. חזור על שלב זה שלוש פעמים נוספות.
4. צנטריפוגה ב 1,350 x גרם במשך 15 דקות כדי pellet תאים שאינם parenchymal. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה ב-10 מ"ל של מדיום בידוד תאי קופפר.
5. הוסף את תמיסת התא הלא פרנכימלי על השיפוע האיזוטוני הלא רציף 25/50% כמתואר ב- 2.3. צנטריפוגה ב 850 x גרם במשך 15 דקות ללא האצה או הפסקה.
6. לוקליזציה של מקטע תא Kupffer מועשר המופיע עכור בתוך מקטע SIP של 25% קרוב לממשק SIP של 25/50% (איור 3). באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, שואפים כ-12 מ"ל של מקטע תאי קופפר מועשר. מעבירים תאים לצינור צנטריפוגה המכיל 35-40 מ"ל של מדיום בידוד תאי קופפר. יש לערבב בעדינות ולצנטריפוגה בגודל 1,350 x גרם במשך 15 דקות ב-4°C לתאי כדור.
7. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את התאים ב-5-10 מ"ל של מדיום תרבית תאי קופפר שחומם מראש. ספירת תאים (המוציטומטר) ומדידת הכדאיות באמצעות צביעה כחולה טריפאן.
8. צלחת את התאים שאינם parenchymal מטוהרים בלוחות 24 באר בצפיפות של 5 x 10⁵ תאים / באר. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2 (איור 3). לאחר 30 דקות, הסירו בעדינות את המדיום, שטפו פעם אחת בתמיסת מלח מאוזנת של Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) שחוממה מראש ואז החליפו אותה ב-500 μl של תרבית תאי קופפר טרייה שחוממה מראש (לכל באר).

תוצאות

איור 1: זילוח כבד. לאחר הרדמת העכבר, מערכת העיכול מועברת לרוחב משמאל לבטן על מנת להפוך את הווריד הפורטלי (PV) לנגיש. PV הוא cannulated באמצעות קצב זרימה איטי (1-3 מ"ל / דקה) של תמיסת EGTA/HBSS ואת הווריד קאווה התחתון (IVC) נקרע מיד כדי למנוע כל לחץ עודף בתוך הכבד. בתוך הדקה הראשונה של הזילוח, קצב הזרימה גדל בהדרגה ל 7 מ"ל / דקה. לאחר מכן מחוררים את תמיסת Collagenase במהירות של 10 מ"ל/דקה עד לקבלת עיכ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Euthatal (נתרן pentobarbital)	מריאל
עכברי CD1	Charles נהר	-	משקל העכבר צריך לנוע בין 35 ל 45 גרם. אנו ממליצים להשתמש בעכברי CD1 זכרים מכיוון שמשקלם עולה במהירות (למשל עכבר CD1 זכר בן 7 שבועות עולה על 35 גרם במשקל). כמו כן, מומלץ ליצור קשר עם ספק בעלי החיים מראש כדי לארגן משלוח של בעלי חיים מבוגרים. לחלופין, בעלי חיים יכולים להיות בבית כדי להגיע למשקל הרצוי.
HBSS (ללא Ca2+ ו-Mg2+, עם ביקרבונט)	לייף טכנולוגיות	14175-053	HBSS חייב להיות Ca2+ חינם.
אתילן גליקול, חומצה טטראצטית (EGTA), מלח טטרסודיום	סיגמא-אולדריץ'	E8145	ניתן להשתמש גם ב- EDTA אך ל- EGTA יש את היתרון של chelating Ca2+ באופן סלקטיבי.
HEPES (1M)	לייף טכנולוגיות	15630-056	100 מ"ל
קולגנאז סוג IV	וורטינגטון	CSL-4	מומלץ לבדוק אצוות שונות של collagenase או לפחות לציין לספק כי המוצר צריך להיות מתאים לבידוד תאי כבד
DMEM דל גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	D5523	500 מ"ל
RPMI (עם נתרן פירובט וגלוטמקס®)	לייף טכנולוגיות	12633-012	500 מ"ל
פניצילין/סטפטומיצין	לייף טכנולוגיות	15140-122	100 מ"ל
סרום בקר עוברי	קישור ראשון	60-00-850	500 מ"ל
פתרון כחול טריפאן	סיגמא-אולדריץ'	T8154	100 מ"ל
תמיסת חלקיקי סיליקה מצופה (Percoll®)	GE Healtcare	17-0891-02	פרקול® יציב מאוד וניתן לשמור עליו מספר שנים
1x מלח חוצץ פוספט	לייף טכנולוגיות	10010-023	500 מ"ל
10x מלח חוצץ פוספט	לייף טכנולוגיות	70011-036	500 מ"ל
סט איסוף דם פרפר (צינורות באורך 23G/305 מ"מ)	ב.ד.	367288
מסנני מזרקים (0.22 מיקרומטר בלו רים)	מיניסארט	16534-K
צינורות צנטריפוגה (50 מ"ל מכסה כחול)	BD Biosciences, פלקון	35 2070
צלחת פטרי (90 x 15 מ"מ)	תרמו פישר סיינטיפיק	BSN 101VR20
מסננת תאים 100 מיקרומטר	ב.ד.	352360
משאבה פריסטלטית	ווטסון מארלו	SciQ 300	יש לשטוף צינורות לפני ואחרי כל שימוש עם PBS סטרילי ואתנול 70%.
צלחות 24 בארות	קורנינג	3526
צנטריפוגה	אפנדורף	5810R
מלקחיים Serrefine	Hammacher GmbH	אמנות. מס' HSE 004-35 / מס' קטלוגי 221-0051	המלקחיים serrefine מאפשרים להדק את כלי הדם cannulated עם מחט 23G ללא צורך להחזיק את המלקחיים במהלך הליך זילוח. כתובת אתר: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)
מגרד תאים	BD Biosciences, פלקון	353086	חותכים גפיים להב עם זוג מספריים כדי לגרד תאים בצלחות 24 באר.
תמיסת EGTA (אתילן גליקול חומצה טטראצטית)/HBSS (תמיסת מלח מאוזנת של האנק)			HBSS המכיל 0.5 mM EGTA ו- 25 mM HEPES. התאם את ה- pH ל- 7.4. הכינו 50 מ"ל לכל כבד לניקוב.
תמיסת קולגנאז			DMEM גלוקוז נמוך המכיל collagenase סוג IV ב 100 UI / ml, 15 mM HEPES ו 1% פניקלין/סטרפטמיצין (v/v). התאם את ה- pH ל- 7.4. הכינו 100 מ"ל לכל כבד לניקוב. לאחר הוספת collagenase, מומלץ לחמם את הפתרון במשך 30 דקות לפני השימוש. זה מאפשר לפעילות הקולגנאז להיות אופטימלית.
מדיום בידוד תאי קופפר			RPMI מכיל, 1% חומצות אמינו לא חיוניות (v/v), 1% גלוטמקס® (v/v) ו-1% פניקלין/סטרפטומיצין (v/v). להכין לפחות 100 מ"ל עבור 1-3 כבדים.
מדיום תרבית תאי קופפר			RPMI המכיל 10% סרום בקר עוברי, 1% חומצות אמינו לא חיוניות (v/v), 1% גלוטמקס® (v/v) ו-1% פניקלין/סטרפטמיצין (v/v). להכין לפחות 100 מ"ל עבור 1-3 כבדים.
SIP (תמיסה של חלקיקי סיליקה מצופים איזוטוניים)			מערבבים 1.7 מ"ל של 10x פוספט חוצץ מלוחים עם 15.3 מ"ל של פרקול® כדי לקבל 17mL של SIP.
פתרון SIP של 25%			לערבב 5 מ"ל של SIP עם 15 מ"ל של 1x פוספט Buffered מלוחים
פתרון 50% SIP			יש לערבב 10 מ"ל של SIP עם 10 מ"ל של 1x פוספט במי מלח חוצצים
חיץ ליזיס			מדיה DMEM עם 0.9% Triton X-100
פתרון PBS/BSA			הכינו pH 7.4 מלח טרי חוצץ פוספט עם אלבומין 1% בסרום בקר.