התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם למקרופאגים

תקציר

מקור: Lopez-Yrigoyen, M., et al. ייצור ואפיון מקרופאגים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטים. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מתאר שיטה במבחנה ליצירת מקרופאגים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs). יצירת מקרופאגים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מתרחשת בשלושה שלבים: (i) צבירה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים בתרחיף ליצירת גופים עובריים תלת-ממדיים (EBs) המתמיינים לתאים מזודרמליים, (ii) היווצרות תאים מקדימים של מקרופאגים מה-EBs המתמיינים, ו-(iii) התמיינות של התאים המקדומים של המקרופאגים למקרופאגים בוגרים ומתפקדים.

פרוטוקול

1. התמיינות iPSC אנושית למקרופאגים

הערה: סיכום סכמטי של פרוטוקול התמיינות המקרופאגים מתואר באיור 1.

1. הכנת התמיינות תאים, גורמי גדילה וריאגנטים אחרים
   1. הכנת מדיה ללא תאי גזע עובריים אנושיים (hESC-SFM; ראה טבלת חומרים) על ידי תוספת של Dulbecco Medium-F12 (DMEM/F12) עם תוסף hESC, אלבומין בסרום בקר (BSA) של 1.8% w/v ו-0.1 mM 2-מרקפטואתנול.
   2. הכינו תמיסת 0.1% w/v של ג'לטין חזירי על ידי המסת הג'לטין למים סטריליים. תמיסת ג'לטין ניתן לאחסן ב 4 ° C עד 2 שנים.
   3. הכן תמיסת מלאי של חלבון מורפוגנטי של עצם אנושית (BMP4) (25 מיקרוגרם/מ"ל) על ידי המסת BMP4 לתמיסת מימן כלורי (HCl) של 4 מילימטר (HCl)-0.2% BSA PBS. להפיץ את פתרון המניות כמו 50 μL aliquots ב cryotubes. ניתן לאחסן פתרונות מלאי ב -20 °C למשך עד שנה. לאחר ההפשרה, BMP4 מלאי ניתן לאחסן ב 4 ° C במשך 5 ימים.
   4. הכן תמיסת מלאי של גורם גדילה אנדותל כלי דם אנושי (VEGF) (100 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי המסת VEGF לתמיסת PBS BSA של 0.2%. להפיץ את פתרון המניות כמו 10 μL aliquots ב cryotubes. ניתן לאחסן פתרונות מלאי ב -20 °C למשך עד שנה. לאחר ההפשרה, ניתן לאחסן VEGF בטמפרטורה של 4°C למשך 7 ימים.
   5. הכן תמיסת מלאי של גורם גזע אנושי (SCF) (100 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי המסת SCF לתמיסת PBS BSA של 0.2%. להפיץ את תמיסת המניות כמו 5 μL aliquots ב cryotubes. ניתן לאחסן פתרונות מלאי ב -20 °C למשך עד שנה. לאחר ההפשרה, מלאי SCF ניתן לאחסן ב 4 ° C במשך 10 ימים.
   6. הכן תמיסת מלאי אינטרלוקין-3 אנושית (IL3) (10 מיקרוגרם/מ"ל) על-ידי המסת IL3 לתמיסת BSA PBS של 0.2%. להפיץ את תמיסת המניות כמו 500 μL aliquots ב cryotubes. ניתן לאחסן פתרונות מלאי ב -20 °C למשך עד שנתיים. לאחר ההפשרה, מלאי IL3 ניתן לאחסן ב 4 ° C במשך 15 ימים.
   7. הכן תמיסת מלאי של גורם מגרה מושבת מקרופאגים אנושית (CSF1) (10 מיקרוגרם/מ"ל) על-ידי המסת CSF1 לתמיסת PBS BSA של 0.2%. להפיץ את פתרון המניות כמו 1 מ"ל aliquots ב cryotubes. ניתן לאחסן פתרונות מלאי ב -20 °C למשך עד שנתיים. לאחר ההפשרה, מלאי CSF1 ניתן לאחסן ב 4 °C במשך 15 ימים.
2. שלב 1: יצירת גופים עובריים (יום 0 – יום 3)
   1. ביום 0, הוסף 2.25 מ"ל של מדיה שלב 1 (hESC-SFM בתוספת 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF ו- 20 ng/mL SCF) לשתי בארות של לוחות 6 בארות חיבור אולטרה-נמוכים
   .
   2. החלף את מדיית התחזוקה של באר אחת 80% של iPSCs בצלחת בעלת 6 בארות עם 1.5 מ"ל של מדיה שלב 1.
   3. חותכים מושבות באמצעות כלי העברת התאים ומעבירים מושבות חתוכות עם פיפטה לשתי בארות של צלחת חיבור נמוכה במיוחד בעלת 6 בארות (ראה טבלת חומרים).
   4. ביום השני, הביאו ציטוקינים לריכוז סופי של 50 ננוגרם/מ"ל BMP4, 50 ננוגרם/מ"ל VEGF ו-20 נ"ג/מ"ל SCF באמצעות 0.5 מ"ל של מדיה hESC-SFM.
      הערה: מושבות IPSC יהפכו ל-EBs (איור 2A).
3. שלב 2: הופעה של תאים hematopoietic בהשעיה
   1. ביום הרביעי, מצפים 4 בארות של צלחת תרבית רקמה 6 בארות עם 0.1% w/v ג'לטין ודגרים במשך 10 דקות לפחות.
   2. הסר את הג'לטין והוסף 2.5 מ"ל של חומרי הדפסה שלב 2 (X-VIVO15 בתוספת 100 ננוגרם/מ"ל CSF1, 25 ננוגרם/מ"ל IL-3, 2 מ"מ גלוטמקס, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-0.055 מ"מ 2-מרקפטואתנול).
   3. לאסוף EBs שנוצרו לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל ולאפשר להם להתיישב בתחתית הצינור על ידי כוח הכבידה. בזהירות לשאוף את התקשורת.
   4. השהה מחדש EBs ב- 2 מ"ל של מדיה שלב 2.
   5. העבר 10-15 EBs (לא יותר מ -15) לבאר מצופה ג'לטין המכילה 2.5 מ"ל של מדיה שלב 2.
   6. יש לדגור על EBs בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂ אוויר.
   7. החליפו מדיה על EBs מצופים כל 3-4 ימים למשך 2-3 שבועות.
   8. לאחר 2-3 שבועות, EBs מתחילים לשחרר תאים hematopoietic שאינם דבקים לתוך תרחיף.
      הערה: תקופה זו של שחרור תאי השעיה יכולה להשתנות והיא תלויה בקו התא. תאים בתרחיף הזה יכולים להיקצר ולהבשיל למקרופאגים (ראו שלב 3) (איור 2A).
4. שלב 3: הבשלת מקרופאגים טרמינליים
   1. לאסוף תאים hematopoietic תרחיף ולחדש מדיה (שלב 2 מדיה) על צלחת EB.
   2. תאי תרחיף צנטריפוגות ב 200 x גרם במשך 3 דקות.
   3. תאי השעיה מחדש במדיה שלב 3 (X-VIVO15 בתוספת 100 ng/mL CSF1, 2 mM glutamax ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין).
   4. צלחת שנאספה וסובבה תאים על פלסטיק לא מטופל צלחות 10 ס"מ ברמה בקטריולוגית (10 מ"ל) או צלחות תרבית רקמה 6 בארות לא מצופות (3 מ"ל) בצפיפות של 0.2 x 10⁶ תאים / מ"ל.
   5. שמור תאים במדיה שלב 3 למשך 9-11 ימים, ושנה מדיה כל 5 ימים.
      הערה: ניתן לחזור על שלבים 1.4.1-1.4.5 משלב 3 כל 3-4 ימים וניתן לקצור תאי תרחיף מצלחת EB המקורית למשך עד 3 חודשים.

תוצאות

איור 1: סיכום גרפי של התמיינות iPSC למקרופאגים פונקציונליים בוגרים. דיאגרמה שצוירה באמצעות Biorender.

איור 2: התמיינות iPSC כלפי מקרופאגים ומספר ומורפולוגיה של iPSC-DM. (A) תמונות שדה בהיר שהתקבלו (משמאל לימין): מושבת IPSC, גופים עוברי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
CellMask כתם קרום פלזמה אדום עמוק	תרמופישר	C10046	מדיה לשימור בהקפאה
קריוסטר CS10	סיגמא	C2874
מצע CTS CELLstart	Invitrogen	A1014201	מצע תאי גזע
ג'לטין לעור חזיר	סיגמא	G9136
חלבון BMP4 אנושי רקומביננטי	מו"פ	314 -BP-010
רקומביננטי אנושי IL3	פרפרוטק	0200-03-10
MCSF אנושי רקומביננטי (ללא נשא) 100ug	ביואגדה	574806
חלבון VEGF אנושי רקומביננטי	מו"פ	293-VE-010
SCF (C-Kit Ligand) חלבון אנושי רקומביננטי	תרמופישר	PHC2111
StemPro hESC SFM	תרמופישר	A1000701
StemPro EZPassage כלי העברת תאי גזע חד פעמיים	תרמופישר	23181010
לוחות חיבור אולטרה-נמוכים: צלחת רב-באר בתרבית תאים, 6 בארות, משטח דוחה תאי כוכב תא	גריינר	657970
2-מרקפטואתנול (50 מילימול)	Invitrogen	31350010
DPBS, סידן, מגנזיום (500 מ"ל)	תרמופישר	14040091
תוסף GlutaMAX	תרמופישר	35050061