$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הביקורת הווטרינרית JoVE.
כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו ונערכו בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. איסוף DRG מותני מעכברי ניסוי
- לפני תחילת הניסוי, הכינו את פתרון העבודה של מדיום שיפוע הצפיפות (למשל, Percoll) על ידי ערבוב 9 כרכים של המדיום עם נפח אחד של Ca++/Mg++-free 10x HBSS. שמור אותו על קרח.
- להרדים את העכבר עם 2.5% Avertin. אשר כי בעל החיים מורדם לחלוטין על ידי חוסר תגובה לצביטת הכף האחורית.
הערה: נעשה שימוש בעכברים זכרים ונקבות בגילאי 6-8 שבועות.
- לנטרל את העכבר באופן טרנסקרדלי עם 10 מ"ל של PBS 1x מקורר מראש.
- הניחו את העכבר במצב שכיבה עם ארבע כפות מאובטחות באמצעות סרט הדבקה בתוך מכסה אדים כימי. הרימו את העור מתחת לכלוב הצלעות על ידי המלקחיים, ובצעו חתך קטן עם מספריים כירורגיים כדי לחשוף את הכבד והסרעפת.
- המשיכו להשתמש במספריים כדי לחתוך את הסרעפת ואת כלוב הצלעות, ופתחו את חלל הפלאורל כדי לחשוף את הלב הפועם.
- חותכים במהירות את תוספתן פרוזדורים ימין עם מספריים קשתית. ברגע שהדימום הוא ציין, להחדיר מחט 30 G לתוך הקצה האחורי של החדר השמאלי, ולהזריק לאט 10 מ"ל של PBS 1x מצונן מראש כדי לנקב את החיה.
- בצע למינקטומיה גבית על העכבר ממוקם במצב נוטה.
הערה: אם מתוכננת תרבית תאים, רססו את העכבר באתנול 70% לפני החתך והשתמשו בכלי ניתוח מעוקרים מראש לנתיחה.
- השתמש באזמל בגודל 11 כדי לבצע חתך עמוק רוחבי אורכי אחד החל מאזור בית החזה ועד לאזור העצה. הסר את העור עם המספריים כדי לחשוף את שכבת שריר הגב.
- השתמש בפרידמן-פירסון רונגור כדי לקלף את רקמות החיבור והשרירים עד לחשיפת תהליכי עמוד השדרה המותני והתהליכים הרוחביים הדו-צדדיים.
- השתמש במספריים של Noyes Spring כדי לפתוח בזהירות את עמוד השדרה הגבי, ולאחר מכן עבור ל- Friedman-Pearson Rongeur כדי להסיר את עצמות החוליות ולחשוף את חוט השדרה עם עצבי עמוד שדרה שלמים מחוברים.
- נתחו בזהירות DRG מותני איפסילטרלי וקונטרלטרלי (L4/L5 DRG במחקר שלנו) והכניסו אותו ל-1 מ"ל של 1x HBSS קר כקרח ללא Ca++/Mg++ בהומוגנייזר של רקמת Dounce. כעת הרקמות מוכנות לשלב 2.
הערה: חתוך את עצב עמוד השדרה המחובר ל- DRG במידת האפשר.
2. בידוד תאים בודדים מ- DRG מותני של עכבר
- הומוגניזציה של רקמת DRG עם מזיק רופף בהומוגנייזר Dounce 20-25 פעמים.
- מניחים מסננת תאי ניילון סטרילית 70 מיקרומטר בצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל. הרטיבו את מסננת התאים עם 800 מיקרוליטר של HBSS 1x קר כקרח, והזרימה נאספת בצינור החרוט.
- לאסוף את תרחיף הרקמה הומוגני מן homogenizer באמצעות פיפטה ולהעביר דרך מסננת תא ניילון רטוב 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
- שטפו את ההומוגנייזר פעמיים עם 800 מיקרוליטר של HBSS 1x קר כקרח ולאחר מכן דקרו אותו לאותו צינור חרוטי של 50 מ"ל עם מסננת תאים כדי להגדיל את התשואה.
- הוסף 1.5 מ"ל של מדיום שיפוע איזוטוני שווה משקל בצפיפות איזוטונית קרה כקרח (מוכן בשלב 1.1) לצינור FAC סטרילי מפוליסטירן 5 מ"ל.
- מעבירים את הומוגנט התא מצינור חרוטי 50 מ"ל (בשלב 2.4) לתוך צינור FACS, ומערבבים היטב עם מדיום שיפוע הצפיפות על ידי פיפטציה למעלה ולמטה. הוסף 500 μL נוספים של 1x HBSS כדי לאטום את החלק העליון.
- גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C.
- יש לשאוף בזהירות את הסופרנאטנט המכיל מיאלין בתווך מבלי להפריע לכדורית התא בתחתית צינור ה-FACS.
- השהה מחדש את התאים במאגר PBS או FACS המכיל 5% סרום בקר עוברי (FBS) לצורך ניתוח FACS.
הערה: לפחות 50,000 עד 100,000 תאים צפויים מ- L4 / L5 DRG של עכבר אחד.
- יש להשהות מחדש את תאי ה-DRG המבודדים מכנית (L4/L5) ב-100 μL של PBS המכילים 5% סרום בקר עוברי ולאחר מכן לדגור עם נוגדן CX3CR1-APC α עכבר (1:2,000) בחושך ב-4°C למשך שעה אחת.
- לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של PBS פעם אחת; צנטריפוגה את התאים 360 x גרם במשך 8 דקות ב 4 °C.
- שאפו את הסופרנטנט, ואז השעו מחדש את גלולת התא ב-300 מיקרוליטר של PBS לצורך ניתוח FCAS. אם מתוכנן מיון תאים, השעה מחדש את התאים במאגר FACS במקום זאת.