כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. כריתה כירורגית ושלבי הכנת רקמות:
- הסרה כירורגית של המעי הדק (SI)
- המתת עכברים באמצעות חנקCO2 או כל שיטה מקבילה שאושרה על ידי ועדת האתיקה המוסדית לבעלי חיים.
- מעבירים את העכבר לאזור ייעודי לכריתה כירורגית. מניחים את החלק האחורי ומחטאים את הבטן עם 70% אתנול. בצע לפרוטומיה על ידי חיתוך עור הבטן והצפק לאורך קו האמצע מהערווה לכלוב הצלעות ובכך לפתוח את חלל הצפק.
הערה: בצע את החתך הראשון על שטח קטן יחסית של העור כדי למנוע חדירה לחלל הצפק ופגיעה ברקמת המעי. ממשיכים את הכריתה עד לגבול האנטומי הרצוי.
- זהה את caecum, שהוא ציון דרך אידיאלי לזיהוי של ileum הטרמינלי, המהווה את המקטע הדיסטלי של המעי הדק.
הערה: Caecum ממוקם בדרך כלל בצד השמאלי התחתון של הבטן של העכבר.
- לאתר את צומת ileocaecal ולעשות חתך ברמה זו דיסטלי ככל האפשר כדי להפריד את המעי הדק מן caecum. במהלך השלבים הבאים, הימנעו ממגע פיזי מוגזם עם דופן המעי מכיוון ש- PPs שבירים קורסים בקלות במגע.
- מוציאים בעדינות את כל המעי הדק עד הסוגר הפילורי על ידי חיתוך המזנטריה באמצעות מספריים. לזהות את הצומת בין פילורוס לתריסריון, ולחתוך את התריסריון ברמה זו, אשר יוביל ניתוק מוחלט של המעי הדק מחלל הבטן.
הערה: (i) הימנע hyperextension כמו זה עלול לגרום לקרע של דופן המעי. (ii) אם רוצים בידוד לימפוציטים LP בנוסף ללימפוציטים PP, יש צורך בהסרה מלאה של השומן המזנטרי. עם זאת, עבור בידוד PP בלבד, שומן מזנטרי שנותר יכול לספק כמה יתרונות במהלך שלבי בידוד נוספים; לכן, זה צריך להישמר.
- מניחים מעי דק מנותק בצלחת בת 6 בארות מלאות בסל"ד קר + סרום בקר עוברי 10% (FBS) ומסעירים בעדינות את הרקמות באופן ידני עד שכל מקטעי המעי שקועים במדיה הקרה. שמור על הרקמות על קרח לאורך השלבים הבאים.
- לאחר ניתוח המספר הרצוי של מעי דק עכבר, להמשיך כריתת PP ממעי דק שנאספו.
- כריתה כירורגית של PPs והכנת תרחיף תא בודד:
- מעבירים בעדינות את המעי הדק על מגבת נייר על ידי אחיזת השומן המזנטרי באמצעות מלקחיים והנחת הצד המזנטרי מול מגבת הנייר. להרטיב את כל קטע המעי עם סל"ד קר + 10% FBS כדי למנוע התייבשות רקמות ודביקות.
הערה: שומן מזנטרי שנותר יכול להיות מועיל בשלב זה מכיוון שמקטעי רקמת שומן בצד המזנטרי של SI יידבקו למגבת הנייר וישמרו על הצד האנטי מזנטרי פונה כלפי מעלה.
- זהה את PPs, המופיעים כאגרגטים לבנים מרובי אונות בצורה "דמוית כרובית" בצד האנטי מזנטרי של דופן המעי.
הערה: לא מומלץ לשטוף את התוכן הלומינלי עד לכריתת כל PPs. ריקון התוכן הלומינלי עלול לגרום לקריסת PPs וימנע את ניגודיות הצבעים בין PPs לדופן המעי, דבר המסייע מאוד לזיהוי חזותי של PPs.
- לאחר זיהוי PPs בצד האנטימנטרי, הניחו את המספריים המעוקלים על PPs (העקומה צריכה לפנות כלפי מעלה) ומרסנים את ה-PP מגבולו הדיסטלי והפרוקסימלי.
אופציונלי: דחפו את ה-PP בעדינות לכיוון להבי המספריים בעזרת קצה אצבע. תמרון זה יוביל להדרה טובה יותר של רקמה שאינה PP שמסביב. הבלו PPs בעדינות, למעט רקמת המעי שמסביב.
הערה: (i) שלב זה חיוני להשגת תפוקה מרבית של תאי PP תוך מזעור זיהום התאים ממדורי מעיים שכנים כגון LP ואפיתל מעיים, שגם הם עשירים בתאי T. (ii) מ-SI אחד שהוצא מעכבר C57BL/6, ניתן לאסוף 5-10 PPs (גודל ממוצע, רב-אונתי). על ידי שאיפה ל- PPs קטנים עוד יותר (לא מרובי אונות), איסוף של עד 12-13 PPs לעכבר (C57BL/6) אפשרי באמצעות פרוטוקול זה.
- מעבירים את ה-PPs שנכרתו לצלחת תרבית רקמה בת 12 בארות מלאה בסל"ד קר כקרח + 10% FBS ומתוחזקת על קרח באמצעות מלקחיים או מספריים כירורגיים מעוקלים.
הערה: (i) מיד לאחר כריתת PPs, ריר ותכולת המעי על פני השטח PP ניתן לנקות על ידי שפשוף עדין של הרקמה על מגבת נייר. צעד זה יסייע לשפר את הכדאיות של לימפוציטים PP. (ii) במקום להעביר את ה-PPs לצלחת, ניתן לשקול גם העברה לצינורות מופרדים בהתאם למספר המדגם הכולל.
- אופציונלי: כאשר כריתת PP והמיקום הבא לתוך צלחת הבאר הושלמו, ניתן לתעד את המספר והגודל של PPs שנאספו מקבוצות ניסוי / עכבר שונות על ידי צילום תמונה של צלחת תרבית הרקמה המכילה PPs.
- הכינו סט של צינורות חרוטיים 50 מ"ל מלאים ב 25 מ"ל של RPMI + 10% FBS (מחומם מראש ב 37 ° C). בעזרת זוג מספריים, חותכים מהמרחק קצה של 1,000 מיקרוליטר שיאפשר את שאיפת ה-PPs עם פיפטה של 1 מ"ל. שואפים את PPs עם פיפטה 1 מ"ל ולהעביר אותם מן צלחת תרבית רקמה 12 באר אל מוכן 50 מ"ל צינורות חרוטיים.
הערה: השתמש בעצה חדשה עבור כל דגימת עכבר כדי למנוע זיהום צולב בין הדגימות.
- הדקו את המכסה והניחו את הצינורות במאונך בשייקר אורביטלי בטמפרטורה של 37°C, עם תסיסה מתמשכת ב-125-150 סל"ד למשך 10 דקות. בינתיים, הכינו סט חדש של צינורות 50 מ"ל והניחו מסננת תאים של 40 מיקרומטר על החלק העליון של כל צינור, שדרכו יוכן תרחיף תא בודד.
הערה: (i) שלב התסיסה יסיר את תכולת המעי הנותרת, ריר ופסולת תאים, אשר יפחיתו את יכולת הקיום וההתאוששות של לימפוציטים מסוג PP אם לא יוסרו. (ii) אין למרוח אנזימי עיכול כלשהם על רקמת PP מכיוון שתהליך העיכול גורם לאובדן דרמטי של ביטוי CXCR5 מפני השטח של התא.
- לאחר התסיסה, העבירו את ה- PPs למסננת התאים של 40 מיקרומטר המונחת על גבי צינורות החרוט החדשים שהוכנו 50 מ"ל. באמצעות הצד המעוגל של בוכנה מזרק 10 מ"ל, לשבש בעדינות את PPs דרך מסננת התא כדי ליצור תרחיף תא יחיד. לשטוף את המסננת עם 15-20 מ"ל של סל"ד קר + 10% FBS.
הערה: (i) לפני הסינון, נער אופקית את הצינורות המכילים את PPs. טלטול קצר זה יקל על העברת PPs למסננות תאים. (ii) מומלץ להשתמש במסננת תאים של 70 מיקרומטר לבידוד תאים חיסוניים שאינם לימפואידים (למשל, מונוציטים, מקרופאגים, DC).
- צנטריפוגה את המתלים החד-תאיים בטמפרטורה של 350-400 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C.
- בזהירות להשליך את supernatant ולהשהות מחדש את התאים בריכוז של 10 x 106 תאים / מ"ל. לספור את התאים באמצעות hemocytometer.