בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים ממעילי באפי אנושיים

תקציר

מקור: Mily, A., et al. קיטוב של M1 ו- M2 תאים שמקורם במונוציטים אנושיים וניתוח עם ציטומטריית זרימה על זיהום Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה, אנו מדגימים את הבידוד של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים, PBMCs, המכילים מונוציטים ולימפוציטים ממעטפת באפי אנושית על ידי צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. ניתן להשתמש במרכזיות המבודדות לניתוח נוסף.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. הכנת מדיה

הערה: פרטים על כל הריאגנטים והחומרים המתכלים מופיעים בטבלת החומרים.

1. RPMI מדיום מלא: תוספת RPMI 1640 עם 1 mM נתרן פירובט, 2 mM L-גלוטמין, 10 mM HEPES, וסרום בקר עוברי 10% מומת חום (FBS). הימנע אנטיביוטיקה בתווך תרבית התא בעת עבודה עם זיהום Mtb.
2. מדיום RPMI ללא סרום: תוספת RPMI 1640 עם 1 mM נתרן פירובט, 2 mM L-גלוטמין, ו 10 mM HEPES.

2. בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים ממעילי באפי

הערה: בצע את כל העבודה עם דם אנושי (שעלול להיות מדבק) בתוך ארון בטיחות ביולוגית Class II. יש להשבית שאריות של מוצרי דם עם חומרי חיטוי למשך 15 דקות לפני השלכה. דם נלקח ממתנדבים בריאים במקרה זה. פרוטוקול התמיינות מקרופאגים במבחנה זה הוגדר כך שיכלול 10 x 10⁶ PBMCs מבודדים / תורם / באר. מכל תורם, מעיל באפי אחד מכיל כ -50 מ"ל של תרחיף לויקוציטים מרוכז שמקורו בדם שלם, אשר בדרך כלל מספק 500-800 x 10⁶ PBMCs שממנו ניתן לאחזר כ -10% או 50-80 x 10⁶ מונוציטים.

1. טען 15 מ"ל של דם מעיל באפי על גבי 15 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות מוכן בצינור 50 מ"ל. שכבו באיטיות את הדם על גבי שכבת שיפוע הצפיפות על ידי השענת קצה פיפטה לדופן הצינור.
2. סובב את הצינורות ב 600 x גרם במשך 25 דקות בטמפ 'החדר (RT) עם 0 תאוצה ו 0 האטה.
   הערה: סגור את המכסים בזהירות לפני הצנטריפוגה ובדוק תמיד את מחזיקי הצינור עבור זליגה פוטנציאלית לאחר צנטריפוגה.
3. הסר את שכבת הפלזמה העליונה עם פיפטת פסטר סטרילית ולאחר מכן לאסוף בזהירות את שכבת התא המונוגרעיני לתוך צינור חדש 50 מ"ל באמצעות פיפטה סטרילית פסטר. הוסף מדיום RPMI ללא סרום לגלולת PBMC לקבלת נפח סופי של 50 מ"ל. מערבבים בזהירות על ידי היפוך הצינור כמה פעמים לפני הצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב RT.
4. השליכו את הסופרנאטנט בזהירות והשעו מחדש את גלולת התא על ידי היפוך תחתית הצינור בתוך האצבעות.
5. כדי להסיר את הזיהום הבינוני של שיפוע הצפיפות מה-PBMCs, יש לשטוף תאים 2-3 פעמים עם סל"ד ללא סרום כדי לקבל נפח סופי של 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב RT. לשטוף עד supernatant התא הופך שקוף.
6. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-20 מ"ל של מדיום סל"ד ללא סרום.
7. ספור את התאים על ידי צביעה כחולה trypan, באופן ידני באמצעות hemocytometer, או באמצעות מונה תאים אוטומטי. לדלל את תרחיף התא בכחול טריפאן בדילול 1:2 או 1:10 על ידי ערבוב הדגימה הכחולה של התא-טריפאן בצלחת של 96 בארות, למשל, 50 μL + 50 μL (לספירת המוציטומטר) או 10 μL + 10 μL (לספירת תאים אוטומטית) ולספור את התאים כדי לקבל את מספר התאים החיים/mL.
   זהירות: כחול טריפאן הוא רעיל ויש להשליכו לפסולת כימית נפרדת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
לימפופר	Alere טכנולוגיות AS	11508545
RPMI 1640	תאגיד טכנולוגיות חיים	SH30096.01
EDTA (מטר 0.5	בית החולים האוניברסיטאי קרולינסקה, הודינגה	לא ישים
נא-פירובט	GE Healthcare מדעי החיים	SH300239.01
ל-גלוטמין	GE Healthcare מדעי החיים	SH30034.01
HEPES	GE Healthcare מדעי החיים	SH30237.01
סרום בקר עוברי (FBS)	סיגמא-אולדריץ'	F7524

)