$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. התמיינות וקיטוב של תאים שמקורם במונוציטים
- השתמש דבקות פלסטיק לבידוד של מונוציטים. בקצרה, זרעו תאי דם חד-גרעיניים היקפיים מבודדים טריים (PBMCs) בצלחת תרבית של 6 בארות בריכוז מתאים, למשל, 10 x 106 PBMCs / באר במדיום RPMI ללא 2 מ"ל בסרום (תוספת RPMI 1640 עם 1 mM נתרן פירובט, 2 mM L-גלוטמין ו 10 mM HEPES) ודגור ב 37 ° C ו 5% CO2.
- לאחר 2-3 שעות, להסיר את התאים שאינם דבקים עם פיפטה ולשטוף את הבארות 3 פעמים עם 1 מ"ל מדיום ללא סרום. התאים המחוברים הם מונוציטים ומהווים כ -10% מכלל PBMCs שנוספו לבאר, כלומר, 106 מונוציטים שנלקחו מ 10 x 106 PBMCs שנוספו לכל באר.
- עבור התמיינות מקרופאגים, הכינו פתרון עבודה המכיל 50 ng/mL GM-CSF או M-CSF עבור קיטוב מקרופאגים M1 ו-M2 בהתאמה, שנוספו ב-2 מ"ל של RPMI מדיום שלם לכל באר. תרבית את התאים באינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C במשך 3 ימים.
- ביום השלישי, הסר 1 מ"ל ממדיום תרבית התאים בזהירות מהשכבה העליונה של כל באר והשלם את תרביות התאים עם 1 מ"ל של מדיום שלם סל"ד טרי המכיל את הריכוז הכפול של M-CSF או GM-CSF כדי לקבל ריכוז סופי של 50 ננוגרם/מ"ל בבארות. הוסף את גורמי הצמיחה בפתרון עבודה מוכן מראש של 100 ננוגרם/מ"ל/באר.
- ביום 6, הוסף גירויים שונים במשך 18-20 השעות האחרונות של התמיינות תאים כדי לקבל M1 מקוטב לחלוטין ובוגר (אינטרפרון-γ; IFN-γ, ו lipopolysaccharide; LPS (E. coli O55:B5)) או M2 (אינטרלוקין 4; IL-4) מקרופאגים. עבור קיטוב M1, יש להכין IFN-γ ו-LPS ב-RPMI Complete Medium (תוספת RPMI 1640 עם 1 mM נתרן פירובט, 2 mM L-גלוטמין, 10 mM HEPES וסרום בקר עוברי 10% מומת חום (FBS)) ולהוסיף 50 μL לכל באר כדי לקבל ריכוז סופי של 50 ng/mL IFN-γ ו-10 ng/mL LPS בתרביות התאים. עבור קיטוב M2, להכין IL-4 בסל"ד להשלים תווך ולהוסיף 50 μL לכל באר כדי לקבל ריכוז סופי של 20 ng / mL בתרביות התא.
- להתמיינות של מקרופאגים מקוטבים M0, לעורר את התאים עם M-CSF בלבד, ללא ציטוקינים נוספים (מתן פנוטיפ דמוי M2).
- בדוק את המורפולוגיה של תרביות תאים שמקורן במונוציטים באופן קבוע במיקרוסקופ אור כדי להבטיח שמונוציטים קטנים יותר מתמיינים לתאים דמויי מקרופאגים גדולים יותר. כמו כן, עקוב אחר הבדלים מורפולוגיים פוטנציאליים בין קיטוב M1 ו- M2, כלומר תאי M1 מוארכים ומתוחים בהשוואה לתאי M2 בעלי צורה מעוגלת יותר.