דור חוץ גופי של תאים דנדריטיים פלסמציטואידים מאבות לימפואידים נפוצים

תקציר

מקור: Chang, S., et al. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים בדיקת מבחנה ליצירת תאים דנדריטיים פלסמקיטואידים (pDCs) מתאי אב לימפואידים נפוצים (CLPs). לאחר תרבית משותפת של CLPs מטוהרים עם תאי הזנה מוקרנים γ בנוכחות ליגנד טירוזין קינאז-3 דמוי FMS (FL), CLPs מתמיינים ל-pDCs שאינם דבקים, שנוכחותם מאושרת באמצעות ציטומטריית זרימה.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת תאי הזנה AC-6

הערה: קו תאי הסטרומה AC-6.21 (AC-6 בקיצור) (מסופק על ידי I. Weissman, אוניברסיטת סטנפורד) צריך להישמר בסל"ד בתוספת 15% נסיוב בקר עוברי מומת בחום (FBS). כדי לשמש כתאי הזנה, תאי AC-6 מוקרנים γ עם 3,000 ראד (30Gy) יום אחד לפני התרבית המשותפת כדי למנוע את התפשטותם. שימו לב שתאי AC-6 נוטים לאבד את יכולת התמיינות שלהם אם הם נותרים צפופים במהלך התחזוקה, או אם מספר המעבר שלהם הוא מעל 20.

1. יש לשטוף תאי AC-6 פעם אחת עם 1 מ"ל מלח חוצץ פוספט (DPBS) של Dulbecco ולהסיר DPBS על ידי שאיפה. טפל בתאי AC-6 עם תמיסת טריפסין 0.8 מ"ל (0.05% טריפסין ו-0.5 mM EDTA ב-DPBS) למשך 3-5 דקות ב-37^מעלותצלזיוס, 5% CO₂ ולאחר מכן עצור את התגובה על-ידי דילול עם 10 נפחים של מדיום תרבית כדי ליצור תרחיף של תא בודד.
2. זרעו תאי AC-6 בגודל 5.9x10⁴ תאים/באר לתוך צלחות 12 בארות ודגרו עליהם ב-37^oC, 5% CO₂ O/N.
   הערה: צפיפות תאי AC-6 חשובה מאוד מכיוון שצפיפות נמוכה יותר תעדיף יצירת cDC. זריעה בצפיפות של 5.9x10⁴ תאים/באר תאפשר ל-AC-6 להגיע למפגש עד למחרת, שהוא אופטימלי לגזירת pDCs מ-CLPs.
3. הקרין תאי AC-6 ב- 3,000 ראד (30 Gy) באמצעות γ-irradiator.
   הערה: המינון המשמש להקרנת AC-6 ממוטב כדי למנוע את התרבות התאים ועם זאת לשמור אותם קיימא מספיק זמן כדי לספק את הציטוקינים ואת מגע התא הדרושים להתמיינות של DCs מ CLPs.
4. יש לשאוף בינוני ולהחליף בסל"ד מלא של 1 מ"ל (סל"ד עם 10% FBS מנוטרל חום, 50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין ו-50 מיקרומטר β-מרקפטואתנול).

2. בידוד תאי BM מעכברים

1. הקרבת עכברים על ידי חנק_CO2 ונקע צוואר הרחם. הניחו את העכברים על מגש דיסקציה ועיקרו אותם עם 70% אתנול. בצע חתך באמצע הבטן והסר את העור מהחלק הדיסטלי של העכבר כולל העור המכסה את הגפיים התחתונות.
2. לנתח עכברים במכסה מנוע סטרילי למחצה. כדי לשחרר את עצם הירך והשוקה, חותכים את עצם הירך מעל ואת השוקה מתחת למפרק הברך. מנתקים את השרירים מהעצמות באמצעות מספריים ומניחים את העצמות בכלי פטרי בקוטר 6 ס"מ המכיל 5 מ"ל סל"ד מלא.
3. לעבור למכסה מנוע של תרבות סטרילית. ממלאים מזרק 3 מ"ל המחובר למחט 27G בסל"ד מלא. חותכים את שני קצוות העצמות באמצעות מספריים, ומחדירים את מחט 27G כדי לשטוף את המח מהעצמות על ידי הזרקה עדינה של סל"ד מלא פעם אחת מכל קצה.
4. הכינו תרחיף חד-תאי על ידי זינוק עדין של התאים למעלה ולמטה 3-5 פעמים בצלחת התרבית באמצעות המזרק ללא המחט.
5. צנטריפוגה את התאים במשך 5 דקות ב 500 x גרם ו decant את supernatant.
6. תאי דם אדומים Lyse עם 1 מ"ל ACK buffer (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0.1 mM EDTA) הדגירה במשך דקה אחת ולעצור את התגובה על ידי דילול עם 10 נפחים של RPMI מלא. אפשר לתאים לעמוד במשך 5 דקות על מנת לפלוט גושי תאים מתים ופסולת רקמות על ידי כוח הכבידה.
   הערה: אין לעמוד יותר מ-5 דקות מכיוון שהדבר יגרום לאובדן תאים עקב התיישבות של תאים בני קיימא.
7. מרוקנים לאט לאט סופרנאטנט המכיל תאים לצינור חדש ומשאירים אחריהם פסולת בצינור המקורי.
8. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500 x גרם כדי pellet את התאים, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant.
9. השהה מחדש את סך תאי BM (בדרך כלל 4-6 x 10⁷ תאי BM מתקבלים מעכבר אחד) במאגר FACS של 100 μl (1x PBS+ 2% FBS+ 1mM EDTA).

3. ניתוח FACS ומיון של CLPs

1. הוסף anti-CD16/32 (hybridoma supernant clone 2.4G2, 50 μl/reaction או 1-2 μg / reaction) לתאים במאגר FACS (שלב 2.9) למשך 1-2 דקות כדי לחסום קולטני Fc.
   הערה: Anti-CD16/32 נקרא גם בלוק Fc, אשר מתווסף כדי למנוע קשירה לא ספציפית של נוגדנים לתאים המבטאים קולטני Fc כולל גרנולוציטים, מונוציטים ולימפוציטים מסוג B.
2. יש להכתים בו זמנית תאים עם הנוגדנים הפלואורסצנטיים הבאים המסומנים בצבע פלואורסצנטי (עבור 4x10⁷ תאים) למשך 15 דקות על קרח, תוך הימנעות מאור הסביבה. נוגדנים: סמני שושלת מצומדים PE (0.0.2 מיקרוגרם כל אחד) כולל אנטי-CD3 (17A2), אנטי-CD8 (53-6.7), אנטי-B220 (RA3-6B2), אנטי-CD19 (eBio1D3), אנטי-CD11b (M1/70), אנטי-Gr-1 (RB6-8C5), אנטי-Thy1.1 (HIS51), אנטי-NK1.1 (PK136), אנטי-TER119 (TER-119) ואנטי-MHC-II (NIMR-4), 0.2 מיקרוגרם נגד C-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 מיקרוגרם נגד Sca-1-FITC (D7), 0.4 מיקרוגרם נגד M-CSFR-APC (AFS98) ו-0.2 מיקרוגרם נגד IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
3. יש לשטוף תאים עם מאגר FACS של 3 מ"ל וצנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות של 500 x גרם.
4. השהה מחדש את התאים במאגר FACS של 300 μl וסנן תאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר.
5. שטפו את הצינור עם מאגר FACS נוסף של 100 μl כדי לשחזר את התאים שנותרו ולסנן לתוך צינור מיון FACS סטרילי באמצעות אותה מסננת תאים.
6. ביצוע ניתוח ציטומטרי זרימה מיד לאחר הצביעה באמצעות מסננים ומתחים מתאימים לזיהוי אותות. השתמש בלייזר 488 ננומטר כדי לזהות את הנוגדנים המסומנים ב- FITC-, PerCP-Cy5.5, לייזר 561 ננומטר כדי לזהות את הנוגדנים המסומנים PE- ו- PE-Cy7, ולייזר 633 ננומטר כדי לזהות את הנוגדן המסומן ב- APC.
7. מיין CLPs לפי הסמנים הבאים: ^{lin-c-kit int}Sca-1^intM-CSFR-IL-7Rα⁺ (כפי שמוכתם בשלב 3.2) באמצעות ממיין תאים. אספו את התאים הממוינים בצינור של 15 מ"ל המכיל 8 מ"ל של סל"ד מלא ככרית.
8. רשום את המספר המוחלט של תאים ממוינים כפי שמוצג על-ידי ממיין התאים בסוף ההפעלה. בדרך כלל, 5x10⁴ CLPs ניתן להשיג BM של עכבר אחד.

4. Coculture CLPs ו-AC-6

1. צנטריפוגו את התאים הממוינים משלב 3.7 למשך 10 דקות ב 500 x גרם, להסיר את supernatant, ולהשהות מחדש את גלולת התא עם מספיק סל"ד מלא כדי לקבל צפיפות תאים של סביב 5x10⁴ תאים / מ"ל. זרעו 500 תאים / גם לתוך צלחת 12 בארות המכילה תאים מזינים שהוכנו בשלב 1.4.
2. הוסף 100 ng/ml FL (hu-Flt3L-Ig שנוצר בתוך החברה באמצעות מערכת ביטוי שסופקה על ידי M. Manz, University Hospital Zürich, Switzerland) ודגרה ב 37^oC, 5% CO₂ עם ניטור חזותי תקופתי של התפתחות DC תחת מיקרוסקופ.
   הערה: FL אנושי רקומביננטי או עכבר FL זמין מסחרית יכול לשמש כתחליף hu-Flt3L-Ig לתמיכה בפיתוח DC.
3. אספו את התאים בסופרנאטנט ביום ה-12 ושטפו את הבארות פעם אחת עם מדיום סל"ד מלא של 0.5 מ"ל המשלב את הסופרנאטנטים המתקבלים. מוסיפים 0.5 מ"ל מדיום טרי ומגרדים את התאים הדבקים בעזרת מגרד תאים.
4. ערבבו את התווך המכיל תאים משני החלקים ואת הצנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות של 500 x גרם.
5. דקנט supernatant ותאי השהיה מחדש במאגר FACS של 50 μl. הוסף 50 μl anti-CD16/32 hybridoma supernatant ולדגור במשך 1-2 דקות כדי לחסום קולטני Fc.
6. ספרו והכתימו את כל התאים עם הנוגדנים הבאים (0.05 מיקרוגרם כל אחד): anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b-FITC ו-anti-B220-PE.
7. שטפו וצנטריפוגו את התאים כמתואר בשלב 3.3.
8. השהה מחדש את התאים במאגר FACS של 100 μl, שער ב- CD11c+ ונתח עבור cDCs (CD11c ⁺ CD11b ⁺ B220^-) ו- pDCs (CD11c ⁺ CD11b ^- B220⁺).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נגד עכבר Ly6g/Ly6c (PE), שיבוט RB6-8C5	ביואגדה	108408	סמן שושלת
נגד עכבר NK1.1 (PE), שיבוט PK136	ביואגדה	108708	סמן שושלת
CD11b נגד עכבר (PE), cloneM1/70	ביואגדה	101208	סמן שושלת
CD19 נגד עכבר (PE), שיבוט eBio1D3	ביואגדה	115508	סמן שושלת
נגד עכבר B220 (PE), שיבוט RA3-6B2	ביואגדה	103208	סמן שושלת/FACS
CD3 נגד עכבר (PE), שיבוט 17A2	ביואגדה	100308	סמן שושלת
CD8a נגד עכבר (PE), שיבוט 53-6.7	ביואגדה	100707	סמן שושלת
נגד עכבר MHC-II (PE), שיבוט NIMR-4	ביואגדה	107608	סמן שושלת
נגד עכבר Ter119 (PE), שיבוט TER-119	ביואגדה	116208	סמן שושלת
Thy1.1 (PE) נגד עכבר, שיבוט HIS51	eBioscience	12-0900-83	סמן שושלת
נגד עכבר M-CSFR (APC), שיבוט AFS98	ביואגדה	135510	FACS
c-Kit נגד עכבר (PerCP/Cy5.5), שיבוט 2B8	ביואגדה	105824	FACS
Sca-1 נגד עכבר (FITC), שיבוט D7	ביואגדה	108106	FACS
נגד עכבר IL-7Ra (PE/Cy7), שיבוט A7R34	ביואגדה	135014	FACS
CD11c נגד עכבר (PerCP/Cy5.5), שיבוט N418	ביואגדה	117328	FACS
CD11b נגד עכבר (FITC), שיבוט M1/70	ביואגדה	101206	FACS
פקסריה השלישי	BD Biosciences		סדרן תאים
צינור מיון FACS	BD Biosciences	352054
פלוג'ו	FlowJo LLC		ניתוח זרימה sofrware