יצירת תאים דנדריטיים לא בוגרים, בוגרים וסובלניים ממונוציטים

תקציר

מקור: Sim, W. J. et al., דור של תאים דנדריטיים לא בוגרים, בוגרים וסובלניים עם פנוטיפים מטבוליים שונים.J. Vis. Exp.(2016).

סרטון זה מדגים את יצירתם של תאים דנדריטיים לא בוגרים, בוגרים וסובלוגניים, או DCs, ממונוציטים אנושיים. הדגירה של מונוציטים עם גורמי גדילה וציטוקינים מובילה לייצור DCs לא בוגרים. בתגובה למולקולות ויסות חיסוניות, DCs לא בשלים מתמיינים ל-DCs סובלרוגניים ובוגרים.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs)

1. הכנת מגיב
   1. הכינו PBS/EDTA: תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) והשלימו עם 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). יש לעקר תמיסה זו על ידי סינון דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר. הערה: יש לאחסן PBS/EDTA בטמפרטורה של 4°C ולחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
   2. הכינו מאגר צביעה: תוסף תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) עם סרום בקר עוברי 2% (FBS), 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), ו-2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). יש לעקר תמיסה זו על ידי סינון דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר.
2. לאסוף דם מ דם Cone
   הערה: חרוט הדם מכיל רכיבי תאי דם לבנים שנאספו לאחר טסיות הדם מבית החולים. אם הדם נאסף בצינורות הפרין או EDTA, לדלל את הדם עם PBS ביחס של 1: 1 ולהמשיך לשלב 1.3; אם מתקבל מעיל באפי, דללו את מעיל באפי עם PBS ביחס של 1:2 והמשיכו לשלב 1.3.
   1. חותכים את שני הקצוות של החרוט כדי לאפשר לדם לזרום החוצה לתוך צינור 50 מ"ל.
      שים לב כי החרוט מכיל בדרך כלל 10 מ"ל של דם.
   2. השתמש מזרק קהה המכיל 30 מ"ל של PBS/EDTA כדי לשטוף את הקונוס ולאסוף אותו בשפופרת 50 מ"ל.
   3. יש לדלל דם נוסף עם PBS/EDTA עד לנפח סופי של 80 מ"ל.
3. בידוד מרכזיות על ידי צנטריפוגה צפופה
   1. Aliquot 15 מ"ל Ficoll כל אחד ל 4 צינורות טריים 50 מ"ל.
   2. השתמשו בפייפ סרולוגי של 25 מ"ל כדי להוסיף 20 מ"ל דם מדולל על שכבת הפיקול. שימו לב להחזיק את הצינור של 50 מ"ל בזווית של 45 ושימו לב לא להפריע לשלב הביניים.
   3. צנטריפוגה את הצינורות ב 805 x גרם ללא בלמים במשך 30 דקות, 20 ° C.
   4. הסירו את שכבת הפלזמה ואספו את טבעת ה-PBMCs השוכבת ממש מתחת לשכבת הפלזמה בעזרת פיפט פסטר. ערבבו ארבע שפופרות של PBMCs לשתי שפופרות של 50 מ"ל. שים לב כדי להימנע מאיסוף השכבה השקופה מתחת למרכזיות.
   5. הוסף PBS/EDTA לנפח סופי של 50 מ"ל לכל צינור PBMCs וצנטריפוגה במהירות 548 x g עם בלמים למשך 10 דקות, 20° C.
   6. יש לשאוף סופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה בכל צינור עם חיץ צביעה של 25 מ"ל ולשלב לצינור אחד של 50 מ"ל.
   7. צנטריפוגה ב 367 x גרם עם הבלמים במשך 5 דקות, 4 ° C.
   8. לשאוף supernatant ו resuspend גלולה עם 10 מ"ל של חיץ מכתים.

2. העשרת מונוציטים על ידי הפרדה מגנטית

1. קביעת מספר תא
   1. קח 20 μl של תרחיף תאי PBMC וערבב אותו עם 20 μl של כחול טריפאן כדי לספור את מספר התאים החיים באמצעות ציטומטר.
   2. מתלה תא צנטריפוגה ב 367 x גרם עם בלמים במשך 10 דקות, 4 ° C.
   3. לשאוף סופרנאטנט לחלוטין ולהשהות מחדש את גלולת התא לריכוז של 10⁷ תאים לכל 80 מיקרוליטר של חיץ צביעה.
2. תיוג מגנטי
   1. הוסף 20 μl של microbeads CD14 לכל 10⁷ תאים, לערבב היטב, לדגור במשך 15 דקות ב 2 - 8 ° C.
   2. לשטוף תאים על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ צביעה לכל 10⁷ תאים וצנטריפוגה ב 367 x גרם עם בלמים במשך 10 דקות, 4 ° C.
   3. לשאוף סופרנאטנט לחלוטין ולהשהות מחדש את גלולת התא בריכוז של 10⁷ תאים לכל 50 מיקרוליטר של חיץ צביעה.
3. הפרדה מגנטית
   1. השתמש בעמודה בגודל בינוני עבור 2 x 10 8 תאים בסך הכל.
      הערה: בחר עמודה ומפריד מתאימים בהתאם למספר התאים הכולל ולמספר תאי CD14⁺ המומלצים בגליון הנתונים.
   2. הניחו את העמוד בשדה המגנטי של מפריד מתאים והכינו את העמוד על ידי שטיפתו ב-500 מיקרוליטר של חיץ צביעה.
   3. תרחיף תאי פיפטה על העמוד ואוסף תאים לא מסומנים שעוברים דרך העמודה עם צינור של 15 מ"ל.
   4. החליפו צינור חדש של 15 מ"ל מתחת לעמוד ושטפו את העמוד 3 פעמים עם 500 μl של חיץ צביעה. ודאו שמיכל העמודים ריק לפני הוספת חיץ צביעה חדש בין השטיפות.
   5. מוציאים את העמוד מהמפריד ומניחים אותו על צינור טרי של 15 מ"ל.
   6. פיפטה 1 מ"ל של חיץ מכתים על העמוד. שטפו מיד את התאים המסומנים מגנטית על ידי דחיפה חזקה של הבוכנה (המסופקת בערכה) לתוך העמודה.
   7. חזור על שלבים 2.3.2 עד 2.3.6 באמצעות המקטע המדולל בעמודה חדשה כדי להגביר את הטוהר של תאי CD14+ . שים לב שהחרוזים ישוחררו מהתאים באופן אוטומטי בתרבית במהלך שלב 3.2.

3. התמיינות של תאים דנדריטיים למצבי הפעלה שונים

1. הכנת מגיב (רמת אנדוטוקסין צריכה להיות פחות מ 0.1 EU/ml בכל הריאגנטים)
   1. הכינו מדיום תרבית תאים: RPMI 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) ו-0.05 מילימטר 2-מרקפטואתנול (2ME). יש לעקר תמיסה זו על ידי סינון דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר.
   2. הכנת ציטוקינים: הרכיבו מחדש את IL-4 ו-GM-CSF במים בדרגת תרבית תאים לריכוז של 0.25 מ"ג/מ"ל בהתאמה בתנאים אספטיים. Aliquot ציטוקינים לתוך 200 μl צינורות microcentrifuge ולאחסן אותם ב -80 ° C.
   3. הכינו ציר ויטמין D3: הרכיבו מחדש ויטמין D3 במים באיכות תרבית תאים לריכוז של 100 מילימטר בתנאים אספטיים. Aliquot ויטמין D3 לתוך 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge ולאחסן ב -20 ° C.
   4. הכנת מלאי דקסמתזון: הרכיב מחדש דקסמתזון במים בדרגת תרבית תאים לריכוז של 10 מ"מ בתנאים אספטיים. Aliquot dexamethasone לתוך 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge ולאחסן ב -20 °C.
   5. הכינו LPS: הרכיבו מחדש ליפופוליסכרידים (LPS) במים בדרגת תרבית תאים לריכוז של 1 מ"ג/מ"ל בתנאים אספטיים. Aliquot LPS לתוך 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge ולאחסן ב -20 ° C.
2. יצירת moDCs שונים
   1. זרעים 4 סטים של מונוציטים CD14⁺ בריכוז של 0.3 - 0.5 x 10⁶/ml של מדיום תרבית תאים בתוספת 200 ng / ml של GM-CSF ו 200 ng / ml של IL-4 ב 6 צלחות באר. שימו לב שזהו יום 0 ונפח המדיום בכל באר 6 הוא 2 מ"ל.
   2. לדגור על תאים באינקובטור תרבית רקמה ב 37 ° C עם 5% CO₂.
   3. הסר 850 μl של מדיום מהתרבית ביום 4 וצנטריפוגה ב 300 x גרם למשך 5 דקות, 4 ° C. לשאוף supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של מדיום תרבית תאים המכיל 2x של (200 ng / ml של GM-CSF ו 200 ng / ml של IL-4). הוסיפו את תערובת התאים בחזרה לתרבית. שים לב כי ריכוז 2x נוסף עבור GM-CSF ו- IL-4 יהפוך 1x כאשר 1 מ"ל של מדיום מתווסף בחזרה לתרבית.
   4. הוסף 1 μl של ויטמין D3 ציר ו 1μl של מלאי dexamethasone לכל מ"ל של בינוני עד שניים של ערכות ביום 5 כדי ליצור moDCs סובלנות. שים לב כי הריכוז הסופי של ויטמין D3 הוא 100 ננומטר ו dexamethasone הוא 10 ננומטר; התוספת של GM-CSF ו- IL-4 אינה נדרשת ביום 5.
   5. הוסף 200 נ"ג/מ"ל של GM-CSF ו-200 נ"ג/מ"ל של IL-4 לכל הסטים ביום השישי.
   6. הוסף 1 מיקרוגרם/מ"ל של LPS לאחת הערכות שטופלו רק ב-GM-CSF וב-IL-4 ביום השישי כדי ליצור moDCs בוגרים.
   7. הוסף 1 מיקרוגרם/מ"ל של LPS לקבוצה אחת של moDCs סובלרוגניים ביום 6 כדי ליצור moDCs עמידים ל-LPS.
   8. קצרו את הסוגים השונים של moDCs ביום 7 על ידי שטיפת צלחת התרבית עם PBS, EDTA עבור ציטומטריית זרימה או מחקרים אחרים. שימו לב שרק תאים שאינם דבקים נקצרים. שים לב כי אחוז התשואה מונוציטים CD14⁺ עבור moDCs לא בוגרים, moDCs בוגרים, moDCs סוברוגניים, ו DCs סובלנות LPS הוא כ 90%, 50%, 60%, ו 60% בהתאמה, ומשתנה בין תורמי דם הרבה FBS.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פיקול	GE שירותי בריאות	17-1440-03	בידוד PBMC
מזרק	בקטון, דיקינסון	302832	בידוד PBMC
צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל	אקסיגן	MCT-150-C	בידוד PBMC
15 מ"ל צינור בז	בז	352096	בידוד PBMC
50 מ"ל צינור בז	בז	352070	בידוד PBMC
צנטריפוגה	אפנדורף	5810R	בידוד PBMC
מסנן 0.2 מיקרומטר	Sartorius stedim biotech	17597	בידוד PBMC
ערכת MACs	Miltenyi ביוטק	130-042-201	העשרת מונוציטים
מפריד MiniMACS	Miltenyi ביוטק	130-042-102	העשרת מונוציטים
מים באיכות תרבית תאים	Invitrogen, Life Technologies		תרבית תאים
סל"ד	גיבקו, לייף טכנולוגיות	11875-093	תרבית תאים
פ.ב.ס.	היקלון	SH30070103	תרבית תאים
פניצילין-סטרפטומיצין	גיבקו, לייף טכנולוגיות	15140	תרבית תאים
מלח חוצץ פוספט	גיבקו, לייף טכנולוגיות	10010-031	תרבית תאים
NEAA	גיבקו, לייף טכנולוגיות	11140-040	תרבית תאים
EDTA	גיבקו, לייף טכנולוגיות	15575	תרבית תאים
HEPES	גיבקו, לייף טכנולוגיות	15630-080	תרבית תאים
נתרן פירובט	גיבקו, לייף טכנולוגיות	11360-070	תרבית תאים
GM-CSF	Miltenyi ביוטק	130-093-868	תרבית תאים
IL-4	Miltenyi ביוטק	130-093-924	תרבית תאים
ויטמין D3	סיגמא	D1530	תרבית תאים
דקסמתזון	סיגמא	D2915	תרבית תאים
LPS	סיגמא	L2755	תרבית תאים
כחול טריפאן	גיבקו, לייף טכנולוגיות	15250-061	תרבית תאים