בידוד וטיהור תאי B מדם היקפי אנושי

תקציר

מקור: Tzeng, S. J. הבידוד, התמיינות וכימות של תאי B מפרישי נוגדנים אנושיים מדם: ELISpot כקריאה פונקציונלית של חסינות הומורלית. J. Vis. Exp. (2016)

בסרטון זה אנו מדגימים את הבידוד של תאי B מדם היקפי אנושי באמצעות נוגדנים ביוטיניליים ספציפיים לתאים שאינם מסוג B ומיקרו-כדוריות מגנטיות מצומדות סטרפטווידין.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית

1. בידוד וטיהור תאי דם היקפיים אנושיים B

1. יש לשאוב ~ 10 מ"ל דם מהווריד הקוביטלי החציוני (בפוסה הקוביטלית הקדמית למרפק) לתוך צינור 15 מ"ל המכיל K₂EDTA (1.5 עד 2.0 מ"ג/מ"ל דם) ומיד להפוך את הצינור מספר פעמים כדי למנוע היווצרות קרישי דם.
2. יש להוסיף 35 מ"ל של חיץ ליזיס של תאי דם אדומים (RBC) (121°C, 15 דקות) (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃ ו-1 mM EDTA; pH 7.4) לצינורית המכילה את דגימת הדם הטרי (≥ 3:1 vol/vol) ולדגור בטמפרטורת החדר (RT) למשך לא יותר מ-5 דקות.
   הערה: המראה של העברת האור דרך הצינור מציין את השלמת הליזה RBC.
3. צנטריפוגה במהירות 600 x גרם ב-RT למשך 5 דקות. ודא שהגלולה בצבע לבן.
4. יש להשהות מחדש את הגלולה עם 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט אוטוקלאבד (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na₂HPO₄ ו-1.47 mM KH₂PO₄; pH 7.4) וצנטריפוגה כמו בשלב 1.3.
5. יש להשליך את הסופרנטנט, להשהות מחדש את הגלולה עם 10 מ"ל סל"ד 1640 בינוני (תוספים: 10% סרום עגל עוברי, 100 U/מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין, 0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B ו-2 מ"ל L-גלוטמין), ולאחר מכן להכניס את התאים לצלחת תרבית בקוטר 10 ס"מ (10 מ"ל דם למנה). מניחים את המנה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 30 דקות.
6. מערבלים בעדינות את צלחת התרבית מספר פעמים ומניחים את מדיום התרבית (תאי תרחיף) לתוך צינורות חרוטי פלסטיק של 15 מ"ל. השליכו את התאים הדבקים (בעיקר מקרופאגים) על צלחות התרבית.
7. צנטריפוגה ב 600 x גרם ב RT במשך 5 דקות. להשליך את supernatant.
8. להשעות את הגלולה עם 1 מ"ל של RPMI 1640 בינוני. ספור את מספר התא באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
   הערה: הכדאיות של לויקוציטים מבודדים היא בדרך כלל גדולה מ -90% על ידי הדרה כחולה טריפאן.
9. צנטריפוגה כמו בשלב 1.7 ולהשהות מחדש את התאים ב~ 200 μL של חיץ PBS קר (0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) ו 2 mM EDTA) בריכוז של 5 - 10 x 10⁶ תאים / מ"ל.
10. הוסף 5 μL של קוקטייל Ab אנטי אנושי biotinylated ספציפי לתאי הדם (לבחירה שלילית של תאי B) לכל 10⁶ תאים ודגור על קרח במשך 30 דקות.
    הערה: קוקטייל Ab האנטי-אנושי צריך לכלול לפחות ABS ספציפיים ל-CD2 (או CD3), CD14 ו-CD16.
11. מוסיפים נפח עודף של פי 10 של PBS סטרילי לתאים, צנטריפוגה של 600 x גרם למשך 5 דקות, ומשליכים את הסופרנטנט.
12. הוסיפו כמויות שוות של מיקרו-כדוריות מצומדות סטרפטווידין (5 μL לכל 10,⁶ תאים) לגלולה וערבבו היטב.
13. יש לדגור על קרח במשך 30 דקות בצינור חרוטי פלסטיק בנפח 15 מ"ל.
14. הוסף 2 מ"ל של חיץ PBS לתוך הצינור.
15. הכניסו את הצינור למעמד מגנטי ודגרו על RT למשך 8 דקות. המיקרו-כדוריות החומות יתחברו בהדרגה לדופן הצינור שליד המגנט.
16. כאשר הצינור נשאר במעמד המגנטי, העבירו בזהירות את הסופרנאטנט לצינור סטרילי חדש של 15 מ"ל.
17. חזור על שלבים 1.14 עד 1.16 ושלב את שני הסופרנאטנטים המכילים את תאי B שלא נגעו בהם. השליכו את המיקרו-כדוריות.
18. צנטריפוגה ב 600 x גרם ב RT במשך 5 דקות. להשליך את supernatant.
19. השהה מחדש את הגלולה בתווך RPMI 1640 לניסויים במורד הזרם.
    הערה: בדרך כלל, 1 - 5 x 10⁵ B תאים עם טוהר גדול מ 95% מ 10 מ"ל של דם היקפי ניתן לבודד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	צינור 10 מ"ל
פיקול-פאק פלוס	GE שירותי בריאות	17-1440-02	ללא אנדוטוקסין
תכיסה כחולה טריפאן 0.5%	תעשיות ביולוגיות	03-102-1B	צבע
IMag סט העשרת לימפוציטים אנושי B	BD Biosciences	558007	מגיב
מיקרו-כדוריות מגנטיות סטרפטאווידין	BD Biosciences	9000810	מגיב
15 מ"ל צינורות בז	BD בז	352196	כלי פלסטיק
CD27 mAb ביוטינילציה	ביואגדה	302804	שיבוט O323
CD27 אנטי אנושי Biotinylated	ביואגדה	302804	שיבוט O323
CD27 אנטי אנושי Biotinylated	eBioscience	13-0279-80	שיבוט O323