מיון תאים מבוסס ציטומטריה של זרימה עבור אוכלוסיות שונות של תאי B במחזור הדם

Abstract

מקור: Tzeng, S. J. הבידוד, התמיינות וכימות של תאי B מפרישי נוגדנים אנושיים מדם: ELISpot כקריאה פונקציונלית של חסינות הומורלית. J. Vis. Exp. (2016).

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול למיון מבוסס ציטומטריה של זרימה של תאי B נאיביים, תאי זיכרון B ותת-אוכלוסיות של תאי פלזמה פלסמה פלסמבלאסטים מתאי דם היקפיים אנושיים מסוג B. ניתן להבחין בין תת-האוכלוסיות השונות של תאי B בהתבסס על קשירת נוגדנים מבוססי פלואורופור לקולטני CD19, CD27 ו-CD38 המבוטאים על פני השטח של תאי B, ולאחר מכן מיון תאים.

Protocol

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. מיון תאים לאיסוף תאי B נאיביים, תאי זיכרון B ותאי פלסמה/פלזמה (PBs/PC)

1. באמצעות תאי דם היקפיים אנושיים מטוהרים B, לקבוע את מספר התא באמצעות hemocytometer או מונה תאים אוטומטי.
2. להשהות מחדש את התאים במאגר PBS קר בריכוז של 10⁷ לכל מ"ל בצינור פוליסטירן 5 מ"ל.
3. הוסף 1 - 2 מיקרוגרם של IgG אנושי לכל 10⁶ תאים ודגור על קרח במשך 10 דקות עבור בלוק Fc.
4. הוסף 1 מיקרוגרם כל אחד של anti-CD19-APC (שיבוט: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (שיבוט: O323) ו- anti-CD38-PE (שיבוט: HIT2) לכל 10⁶ תאים; מערבבים היטב ודגורים על קרח במשך 30 דקות.
5. ב-5 הדקות האחרונות בשלב 1.4, הוסף 5 μL של 7-amino actinomycin D (7-AAD) המסחרי.
6. הוסף 2 מ"ל PBS לצינור, מערבולת וצנטריפוגה ב 600 x גרם למשך 5 דקות.
7. השהה מחדש את התאים במאגר מיון (PBS סטרילי עם 2% BSA ו- 2 mM EDTA) בריכוז של 1 - 5 x 10⁷ תאים למ"ל בצינור של 15 מ"ל.
8. סנן את התאים דרך מסננת תאי רשת ניילון (גודל נקבוביות של 40 מיקרומטר) כדי למנוע גושי תאים.
9. הפרד את התאים באמצעות ממיין ציטומטרי זרימה המצויד בשלושה לייזרים: סגול (405 ננומטר), כחול (488 ננומטר) ואדום (640 ננומטר).
   הערה: הלייזר הכחול לבדו מספיק עבור ציטומטריית זרימה של 3 צבעים.
10. מיין את התאים לשלוש שפופרות של 15 מ"ל (המכילות 5 מ"ל של תווך סל"ד) לאיסוף סימולטני של תאי B נאיביים (CD19⁺CD27^-), תאי זיכרון B (CD19⁺CD27⁺) ומרכזיות/מחשבים אישיים (CD19^+CD27+/hiCD38⁺).
    הערה: תאי נאיביות ממוינים ותאי זיכרון B ניתנים לתרבית נוספת.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 מ"ל צינורות בז	BD בז	352196
מסננת תאי רשת ניילון כחולה, 40 מיקרומטר	BD בז	352340
CD19-APC אנטי-אנושי	ביואגדה	302212	שיבוט HIB19
CD27-eFluor 450 אנטי-אנושי	eBioscience	48-0279-42	שיבוט O323
CD38-PE-Cy7 אנטי-אנושי	ביואגדה	303516	שיבוט HIT2
CD38-PE-Cy7 אנטי-אנושי	BD Biosciences	560677	שיבוט HIT2
CD45-FITC אנטי-אנושי	ביואגדה	304006	שיבוט HI30
CD45-FITC אנטי-אנושי	BD Biosciences	555482	שיבוט HI30
נגד עכבר / חולדה / אדם CD27- PerCP Cy5.5	ביואגדה	124213	שיבוט LG.3A10
אנטי אנושי CD27-PerCP Cy5.5	BD Biosciences	65429	שיבוט L128
CD19-FITC אנטי-אנושי	Miltenyi ביוטק	130-098-064	שיבוט LT19
CD19-FITC אנטי-אנושי	GeneTex	GTX75599	שיבוט LT19
CD20-FITC אנטי-אנושי	BD Biosciences	555622	שיבוט 2H7
7-אמינואקטינומיצין D (7-AAD)	BD Biosciences	559925
IgG אנושי	ג'קסון מחקר חיסוני	009-000-003