$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
יש לקבל דם היקפי אנושי מתורמים בריאים בהסכמה מדעת, והשימוש בדגימות דם חייב להתאים להנחיות המאושרות שנקבעו על ידי ועדות בדיקה. במחקר זה, פרוטוקול השימוש בדם אנושי בהדגמה של התוצאות של ציטומטריית זרימה (איור 1) ומבחני ELISpot (איור 2).
1. בידוד וטיהור תאי דם היקפיים אנושיים B
- יש לשאוב ~ 10 מ"ל דם מהווריד הקוביטלי החציוני (בפוסה הקוביטלית הקדמית למרפק) לתוך צינור 15 מ"ל המכיל K2EDTA (1.5 עד 2.0 מ"ג/מ"ל דם) ומיד להפוך את הצינור מספר פעמים כדי למנוע היווצרות קרישי דם.
- הוסף 35 מ"ל של חיץ ליזיס של תאי דם אדומים (RBC) (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 ו- 1 mM EDTA; pH 7.4) לצינורית המכילה את דגימת הדם הטרי (≥ 3:1 vol/vol) ודגור בטמפרטורת החדר (RT) למשך לא יותר מ- 5 דקות.
הערה: המראה של העברת האור דרך הצינור מציין את השלמת הליזה RBC.
- צנטריפוגה במהירות 600 x גרם ב-RT למשך 5 דקות. ודא שהגלולה בצבע לבן.
- יש להשהות מחדש את הגלולה עם 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט אוטוקלאבד (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4 ו-1.47 mM KH2PO4; pH 7.4) וצנטריפוגה כמו בשלב 1.3.
- יש להשליך את הסופרנטנט, להשהות מחדש את הגלולה עם 10 מ"ל סל"ד 1640 בינוני (תוספים: 10% סרום עגל עוברי, 100 U/מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין, 0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B ו-2 מ"ל L-גלוטמין), ולאחר מכן להכניס את התאים לצלחת תרבית בקוטר 10 ס"מ (10 מ"ל דם למנה). מניחים את המנה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 30 דקות.
- מערבלים בעדינות את צלחת התרבית מספר פעמים ומניחים את מדיום התרבית (תאי תרחיף) לתוך צינורות חרוטי פלסטיק של 15 מ"ל. השליכו את התאים הדבקים (בעיקר מקרופאגים) על צלחות התרבית.
- צנטריפוגה ב 600 x גרם ב RT במשך 5 דקות. להשליך את supernatant.
- להשעות את הגלולה עם 1 מ"ל של RPMI 1640 בינוני. ספור את מספר התא באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
הערה: הכדאיות של לויקוציטים מבודדים היא בדרך כלל גדולה מ -90% על ידי הדרה כחולה טריפאן.
- צנטריפוגה כמו בשלב 1.7 ולהשהות מחדש את התאים ב~ 200 μL של חיץ PBS קר (0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) ו 2 mM EDTA) בריכוז של 5 - 10 x 106 תאים / מ"ל.
- הוסף 5 μL של קוקטייל Ab אנטי אנושי biotinylated ספציפי לתאי הדם (לבחירה שלילית של תאי B) לכל 106 תאים ודגור על קרח במשך 30 דקות.
הערה: קוקטייל Ab האנטי-אנושי צריך לכלול לפחות ABS ספציפיים ל-CD2 (או CD3), CD14 ו-CD16.
- מוסיפים נפח עודף של פי 10 של PBS סטרילי לתאים, צנטריפוגה של 600 x גרם למשך 5 דקות, ומשליכים את הסופרנטנט.
- הוסיפו כמויות שוות של מיקרו-כדוריות מצומדות סטרפטווידין (5 μL לכל 10,6 תאים) לגלולה וערבבו היטב.
- יש לדגור על קרח במשך 30 דקות בצינור חרוטי פלסטיק בנפח 15 מ"ל.
- הוסף 2 מ"ל של חיץ PBS לתוך הצינור.
- הכניסו את הצינור למעמד מגנטי ודגרו על RT למשך 8 דקות. המיקרו-כדוריות החומות יתחברו בהדרגה לדופן הצינור שליד המגנט.
- כאשר הצינור נשאר במעמד המגנטי, העבירו בזהירות את הסופרנאטנט לצינור סטרילי חדש של 15 מ"ל.
- חזור על שלבים 1.14 עד 1.16 ושלב את שני הסופרנאטנטים המכילים את תאי B שלא נגעו בהם. השליכו את המיקרו-כדוריות.
- צנטריפוגה ב 600 x גרם ב RT במשך 5 דקות. להשליך את supernatant.
- השהה מחדש את הגלולה בתווך RPMI 1640 לניסויים במורד הזרם.
הערה: בדרך כלל, 1 - 5 x 105 B תאים עם טוהר גדול מ 95% מ 10 מ"ל של דם היקפי ניתן לבודד.
2. טיהור והפרדה של זיכרון ותאי B נאיביים מתאי B מבודדים
- השתמש בתאים שטוהרו משלב 1 וקבע את מספר התא באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
- להשהות מחדש את התאים ב 100 μL של חיץ PBS קר לאחר צנטריפוגה ב 600 x גרם RT במשך 5 דקות.
- הוסף 1 - 2 מיקרוגרם של CD27 mAb biotinylated לכל 106 תאים לדגור על קרח במשך 30 דקות.
- הוסף 10 מ"ל של חיץ PBS לצינור וצנטריפוגה ב 600 x גרם למשך 5 דקות.
- השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-50 מיקרוליטר של מאגר PBS.
- הוסף כמויות שוות של מיקרו-כדוריות מגנטיות סטרפטאווידין (1 - 2 מיקרוגרם/106 תאים) לתאים בצינור חרוטי פלסטיק בנפח 15 מ"ל.
- מערבבים היטב בעדינות ודורים על קרח במשך 30 דקות.
- הוסף 2 - 3 מ"ל של מאגר PBS לצינור.
- הכניסו את הצינור למעמד מגנטי ודגרו על RT למשך 8 דקות כדי לאפשר למיקרו-כדוריות החומות להיצמד לצד הקרוב ביותר למגנט.
- עם הצינור במעמד המגנטי, העבירו בזהירות את החלק הסופרנאטנטי לצינור סטרילי חדש. חלק זה מכיל את תאי B הנאיביים המועשרים CD27.
- הוסף 5 מ"ל לצינור המכיל את המיקרו-כדוריות והשהה מחדש בעדינות את המיקרו-כדוריות (כלומר, החלק המועשר של תאי זיכרון B CD27+).
- צנטריפוגה במהירות 600 x גרם ב-RT למשך 5 דקות. השהה מחדש את הכדורים עם מדיום RPMI 1640 לניסויים במורד הזרם.
הערה: בדרך כלל, ~ 30 - 60% מתאי B יכולים להיות מטוהרים כתאי זיכרון CD27+ מה- PBMCs של תורם בריא.
3. מיון תאים לאיסוף תאי B נאיביים, תאי זיכרון B ומרכזיות/מחשבים אישיים
- באמצעות התאים שטוהרו משלב 1, קבע את מספר התא באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
- להשהות מחדש את התאים במאגר PBS קר בריכוז של 107 לכל מ"ל בצינור פוליסטירן 5 מ"ל.
- הוסף 1 - 2 מיקרוגרם של IgG אנושי לכל 106 תאים ודגור על קרח במשך 10 דקות עבור בלוק Fc.
- הוסף 1 מיקרוגרם כל אחד של anti-CD19-APC (שיבוט: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (שיבוט: O323) ו- anti-CD38-PE (שיבוט: HIT2) לכל 106 תאים; מערבבים היטב ודגורים על קרח במשך 30 דקות.
- ב-5 הדקות האחרונות בשלב 3.4, הוסף 5 μL של 7-amino actinomycin D המסחרי (7-AAD).
- הוסף 2 מ"ל PBS לצינור, מערבולת וצנטריפוגה ב 600 x גרם למשך 5 דקות.
- השהה מחדש את התאים במאגר מיון (PBS סטרילי עם 2% BSA ו- 2 mM EDTA) בריכוז של 1 - 5 x 107 תאים למ"ל בצינור של 15 מ"ל.
- סנן את התאים דרך מסננת תאי רשת ניילון (גודל נקבוביות של 40 מיקרומטר) כדי למנוע גושי תאים.
- הפרד את התאים באמצעות ממיין ציטומטרי זרימה המצויד בשלושה לייזרים: סגול (405 ננומטר), כחול (488 ננומטר) ואדום (640 ננומטר).
הערה: הלייזר הכחול לבדו מספיק עבור ציטומטריית זרימה של 3 צבעים.
- מיין את התאים לשלוש שפופרות של 15 מ"ל (המכילות 5 מ"ל של תווך סל"ד) לאיסוף סימולטני של תאי B נאיביים (CD19+CD27-), תאי זיכרון B (CD19+CD27+) ו-PBs/PC (CD19+CD27+/hiCD38+).
הערה: ניתן לגדל תאי נאיביות וזיכרון B ממוינים כמתואר בשלב 4.
4. התמיינות חוץ גופית של תאי CD19+ B אנושיים מבודדים, CD19+CD27+ תאי זיכרון B ותאי CD19+CD27- תאי B נאיביים
- באמצעות התאים שטוהרו בשלבים 1.19, 2.10, 2.11 ו- 3.10, קבע את מספר התא באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
- להשעות את התאים עם RPMI 1640 בינוני בריכוז של 1 - 10 x 105 לכל מ"ל ו aliquot אותם לתוך בארות של צלחת 12 בארות.
- הוסף CpG (ODN 2006) ב- 5 מיקרוגרם/106 תאים/מ"ל.
- תרבית את התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 5 ימים.
- קצרו את התאים מכל באר, הכניסו אותם בנפרד לצינורות של 15 מ"ל, הוסיפו 5 מ"ל PBS לכל צינור, וצנטריפוגו אותם ב 600 x g ו- RT למשך 5 דקות.
- ספור את התאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי. להשעות את התאים בריכוז של 1 - 10 x 105 לכל מ"ל עם RPMI 1640 בינוני.
5. בדיקת ELISpot
- הוסף 30 μL של 35% אתנול במים מזוקקים לכל באר של צלחות ELISpot במשך 30 s.
הערה: בעת פיפט, הימנע מלגעת בקרום בבארות בכל עת.
- הפוך את לוחות ELISpot כדי להסיר את האתנול.
- שים 150 μL של autoclaved ddH2O לתוך כל באר לדגור אותם ב RT במשך 5 דקות כדי לשטוף את אתנול שיורי; לאחר מכן יש לשטוף PBS סטרילי ב-RT למשך 3 דקות.
הערה: שלבים 5.1 עד 5.3 עשויים להיות אופציונליים, בהתאם לייצור הלוחות.
- שים 50 μL של 5 מיקרוגרם / מ"ל רב-שבטי F(ab')2 קטע של Ig אנטי אנושי (IgG + IgM + IgA) (ב- PBS) לכל באר של לוחות ELISpot ודגר אותם ב 4 ° C ללילה (מועדף) או 37 ° C במשך 2 שעות.
הערה: אוטמים את שולי הצלחות עם Parafilm עד לשימוש.
- הפוך את הלוחות כדי להסיר שרירי בטן לא קשורים, הוסף 200 μL של PBS לכל באר, ודגר עליהם פעמיים ב- RT במשך 3 דקות בכל פעם.
- הוסף 200 μL של PBS עם 5% BSA (או RPMI 1640 בינוני) לכל באר לחסימה, ודגר אותם ב RT במשך 2 שעות.
- הפוך את הלוחות כדי להסיר את מאגר החסימה. לשטוף כל באר פעמיים עם 200 μL של PBS, כמו בשלב 5.5.
- מוסיפים 100 μL של סל"ד 1640 בינוני לכל באר ודגרים עליהם ב 37 ° C.
- כאשר מוכנים לזרוע את התאים, להפוך את הלוחות כדי להסיר את מדיום RPMI 1640.
- זרע 100 μL (5 x 104), 50 μL (2.5 x 104) ו- 25 μL (1.25 x 104) של התאים (משלבים 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 ו- 4.6) לתוך בארות של צלחת ELISpot. עם מדיום RPMI 1640, הביאו את הנפח ל-150 מיקרוליטר/באר.
הערה: מומלץ לבצע דילול סדרתי אחד או שניים לפחות פי 2 לציפוי התאים.
- לדגור על הצלחות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 8 - 14 שעות. הימנע מהזזת הצלחות במהלך הדגירה.
- הפוך את הלוחות כדי להסיר את התאים ואת מדיום RPMI 1640.
- הוסיפו 200 μL/well של PBS-T (PBS עם 0.05% Tween 20) ודגרו עליהם 5 פעמים ב-RT, בכל פעם למשך 3 דקות. הפכו את הצלחת כדי להסיר את חיץ הכביסה בין כל אחת מ-5 השטיפות.
- הוסף לבארות הייעודיות מסוג IgG-alkaline phosphatase נגד בני אדם (AP), ABS ספציפי ל-Fcγ (לזיהוי IgG, 1:5,000 ב-PBS-T) או IgM-AP אנטי-אנושי, Fcμ Fragment-specific Abs (לגילוי IgM, 1:5,000 ב-PBS-T) לתוך הבארות המיועדות ודגרה ב-RT במשך שעתיים בחושך.
- לשטוף כל באר פעמיים עם 200 μL של PBS, כמו בשלב 5.5.
- הוסף 50 μL / באר של bromochloroindolyl phosphate-nitro כחול tetrazolium (BCIP / NBT) תמיסת מצע. כתמים בצבע סגול מופיעים בדרך כלל תוך 5 - 15 דקות.
- הוסף 100 μL / באר של ddH2O כדי למנוע התפתחות יתר של כתמים.
- שטפו את הצלחות במי ברז זורמים לאחר התפתחות מלאה של כל הכתמים.
- הסר את הניקוז התחתון של הצלחות ולאפשר להם להתייבש באוויר בחושך.
- ספור את הכתמים באמצעות קורא לוחות אוטומטי עם יחידת רכישה/ניתוח תמונה (לדוגמה, סורק אוטומטי או ידנית באמצעות מיקרוסקופ מנתח).
הערה: ניתן לאחסן את הצלחות ב- RT בחושך ולנתח מאוחר יותר.
