כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. קציר עצמות מעכברים
- הרדימו את בעלי החיים באמצעותCO2 ואחריו נקע צוואר הרחם ורססו אותם באתנול 70.
הערה: ודא כי בעלי חיים מאותו המין רצוי באותו גיל משמשים. אנו משתמשים באופן שגרתי בבעלי חיים בגילאי 7 עד 8 שבועות. אנו ממליצים על איגום תאים מלפחות 3 בעלי חיים בכל קבוצת ניסוי כדי להניב אוכלוסיית תאים מייצגת וניתנת לשכפול טובה יותר.
- הניחו את העכבר המורדם על גבו על לוח ניתוח. השתמש במלקחיים כדי ליצור אוהל של עור על הבטן. בצע חתך קטן (סביב 1 ס"מ) באמצעות מספריים ניתוח סטרילי. מקלפים את העור לאחור לכיוון הגפיים ואת כפות הרגליים מהחתך על מנת לחשוף את הבטן התחתונה ואת הרגליים.
- חתכו מתחת למפרק הקרסול כדי להסיר את כף הרגל. חותכים לאורך הפסגה האיליאק בירך כדי להפריד את ראש עצם הירך מעצם הירך. כאשר העכבר עדיין על גבו, בצע חתך באמצע עצם הירך כדי להפריד בין שתי עצמות האיליאק.
- באמצעות מגבונים ללא מוך, להסיר בזהירות את השריר מן עצם הירך, tibias, ועצמות iliac.
הערה: חיתוך כמה שיותר של הגידים והשרירים מהעצם הופך את הניקוי למהיר וקל יותר עם המגבונים ללא סיבים (למשל, מגבוני קים). השתמש בזהירות בעת מניפולציה את העצמות כפי שהם נוטים להישבר בקלות ואת השבריריות שלהם עשוי להיות מוגברת עם גנוטיפים מסוימים.
- לאחר שכל הדגימות נותחו, הניחו אותן ב-PBS על קרח ועברו למכסה מנוע סטרילי לשאר שלבי הבידוד.
הערה: עבודה אספטית ככל האפשר תפחית את פוטנציאל הזיהום בתרביות.
- בצע חתכים קטנים (כ 1 עד 2 מ"מ) בשני הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של העצמות לפני הצבתם בקצוות חתוכים בתוך צינורות הצנטריפוגה.
הערה: הקפד לחתוך כמות מספקת, כך מח יכול להיות צנטריפוגה החוצה; עם זאת, יש להקפיד להימנע מחיתוך רב מדי מכיוון שאוכלוסיות התאים נוטות להשתנות בהתאם לקרבה בתוך חלל המח.
- צנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 15 שניות בטמפרטורת החדר. ודא שכל המח סמוק וגלול בתחתית הצינור של 1.5 מ"ל בזמן שהעצמות נמצאות בתוך התוספות (או קצה צינור צינור 200 מיקרוליטר או צינור מיקרוצנטריפוגה 0.75 מ"ל). לאחר איסוף כל המח, הסר את התוספות עם העצמות מצינורות האיסוף.
הערה: אם כל המוח סמוק, העצמות ייראו לבנות. עם זאת, אם מח נשאר בעצמות מסוימות, נסה לחתוך קצוות שוב צנטריפוגה.
2. תרחיף תאים
- באמצעות מחט 25 גרם, משוך את כדורי התא למעלה ולמטה באיטיות כדי לפרק גושים ולשלב את כל הדגימות לצינור חרוטי יחיד של 15 מ"ל. הוסף 10 מ"ל של BMSC Culture Media לכל 500 μL של דגימות.
- הניחו מסנן של 70 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי של 50 מ"ל והעבירו את תרחיף התא דרך מסנן זה על מנת להסיר שברי עצם אפשריים.
3. ציפוי ותרבית של אוכלוסיות מעורבות של תאי מח עצם (סה"כ BMC)
הערה: תאים מתורבתים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור עם 5% CO2.
- חשב את מספר התאים וצלחת אותם ב 1.0 x 106 תאים / ס"מ2 במדיה תרבית. אפשר 72 שעות של תרבית מעורבת לתאים להתחבר.
הערה: אנו ממליצים לדלל את תרחיף התאים פי 20 בתרבית ולדלל שוב בכחול טריפאן לפני ספירת התאים באמצעות המוציטומטר. עבור עכברי C57Bl6/J זכרים בני 7 שבועות, אנו מניבים באופן שגרתי מספר תאים של כ 50 x 106 תאים, אך גיל, מין ומתח יכולים להשפיע מאוד על מספר התאים.
הערה: אוכלוסייה מעורבת של תאים צריכה להתחבר היטב בתחתית התרבית.
- לאחר 72 שעות, הסר את המדיה והחלף אותה במדיה חדשה. המשיכו להחליף את המדיה כל יומיים ובדקו אם יש התמזגות. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80-100%, הם מוכנים להתמיינות.
הערה: מכיוון שתרבות זו מעורבבת עם BMSCs ו- HSCs, ניתן להשתמש בה ישירות עבור אוסטאובלסטוגנזה, אדיפוגנזה וכן אוסטיאוקלסטוגנזה.
4. ציפוי ותרבות האוכלוסייה המפוצלת של BMSCs (BMSCs דבקים)
הערה: תאים מתורבתים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור עם 5% CO2.
- צלחת את כל התאים שנאספו מן עצם הירך, tibias, ועצמות iliac של עכבר אחד לתוך צלחת תרבית 10 ס"מ (55 ס"מ2 של שטח התרבית).
הערה: בעת איגום 2-3 עכברי C57BL/6J, אנו בדרך כלל לוחים את אוכלוסיית מח העצם 'הכוללת' הזו בצלוחיתשל 150 ס"מ 2.
- לאחר 48 שעות של תרבות מעורבת, הסר את מדיית התרבות (המכילה את HSCs שאינם דבקים). אם רוצים לבצע ניסויי אוסטאוקלסטוגנזה, הניחו את אוכלוסיית התאים הלא דבקים בצד (ראו סעיף 7), אם לא, שאפו והשליכו תאים אלה.
- שטפו את הצלחת/בקבוק עם PBS בזהירות כדי לא להפריע לתאים המחוברים.
- הסר PBS והרם את התאים על ידי הוספת 0.25% טריפסין ודגירת 37°C למשך 1-3 דקות. הרוו את הטריפסין על ידי הוספת מדיה תאית לתרחיף התא. בשלב זה, BMSCs, אשר הוסרו כעת, ניתן לספור (כפי שנעשה בעבר בשלב 4.1) ולצפות עבור ניסויים עתידיים.
- חשב את מספר התאים הדרושים לציפוי. צנטריפוגה את הנפח הנדרש של מתלה התא ב 1,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: תאים מצופים בדרך כלל בהתבסס על ניסויים בנקודות קצה. לדוגמה, אם רוצים לבודד חלבון/רנ"א, אנחנו בדרך כלל מבודדים בצפיפות גבוהה יותר (~1.0-2.0 x 106 תאים/באר בצלחת של 6 בארות).
- הסר את המדיה והשהה מחדש את גלולת התא בנפח של מצע התרבית הדרוש לציפוי. לוחצים את התאים בתרבית בהתאם לניסויים ומאפשרים להם להתחבר במשך כמה ימים. כאשר BMSCs מגיעים למפגש, להמשיך לבצע בידול.
