תרבית תאי T פעילים מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים

תקציר

מקור: Mølgaard, K., et al. ניטור בזמן אמת של נשימה מיטוכונדריאלית בתאי T ראשוניים אנושיים ממוינים ציטוקינים. J. Vis. Exp. (2021).

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול להפעלת תאי T ראשוניים אנושיים. הדגירה של תאי T נאיביים עם חרוזים מגנטיים המצופים בנוגדנים נגד CD3 ונגד CD28, ולאחר מכן טיפול באינטרלוקין-2 או אינטרלוקין-15, מובילה להפעלת תאי T נאיביים ולהתמיינותם והתפשטותם לתאי T משפיעים או זיכרון.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. תרבית לימפוציטים אנושיים ראשוניים פעילים מסוג T

1. הפשרת תאים (יום 1)
   1. טרום חם 10 מ"ל של RPMI 1640 לכל מדגם בסביבות 37 ° C.
   2. קח את המספר הרצוי של אמפולות תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם ואחסן אותם באופן זמני על קרח יבש.
   3. להשעות מחדש את התאים הקפואים ב 10 מ"ל של RPMI מחומם מראש 1640.
   4. צנטריפוגה את התאים במשך 5 דקות ב 500 x גרם ב RT.
   5. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו שוב את התאים על ידי השהיה מחדש ב-10 מ"ל סל"ד 1640 וצנטריפוגה כמתואר ב-1.1.4.
   6. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב 2 x 10⁶ תאים למ"ל של X-VIVO 15 בינוני + 5% סרום אנושי (להלן: T cell medium).
   7. צלחת 2 מ"ל של תאים לכל באר בצלחת תרבית תאים 24 באר לדגור לילה ב 37 ° C ו 5% CO₂.
2. הפעלת תאים (יום 0)
   1. לשטוף חרוזי CD3 / CD28 על ידי העברת 12.5 μL של חרוזים לכל 1 מיליון תאים לצינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף 12.5 μL של PBS לכל 12.5 μL של חרוזים.
      הערה: חשוב לערבב את בקבוקון החרוזים לפני השימוש.
   2. הניחו את צינור המיקרוצנטריפוגה על מגנט מתאים למשך דקה.
   3. השליכו את המאגר והשהו מחדש את החרוזים בנפח המקורי של תווך תא T (12.5 מיקרוליטר של תווך תא T לכל 12.5 מיקרוליטר מהנפח המקורי של החרוזים).
   4. הוסף 12.5 μL של חרוזים לכל מיליון תאים המתאימים ליחס של 1:2 (חרוזים: תאים).
   5. חלקו את התאים לשני תנאים עם כ-5 מיליון תאים בכל אחד מהם.
   6. הוסף את הנפח הנכון של ציטוקינים לתנאים כפי שמוזכר בטבלה 1.
   7. לדגור על התאים במשך 3 ימים ב 37 ° C ו 5% CO₂.
3. גידול תאים (ימים 3 ו-5)
   1. השהה מחדש את התאים ופצל אותם על ידי העברת מחצית הנפח מכל באר לבאר חדשה. הוסיפו את אותו נפח של מדיום תאי T טריים לכל באר.
   2. הוסף ציטוקינים חדשים לכל מצב כפי שמוזכר בטבלה 1.

	ציטוקין	מניות	גורם דילול	הסופי
תנאי 1	IL-2	3 x 106 U/מ"ל	30,000	100 U/מ"ל
תנאי 2	IL-15	2 x 105 U/מ"ל	2,000	100 U/מ"ל

טבלה 1: הכנת תרביות ציטוקינים המשמשות להנחיית שינויים מטבוליים בתאי T.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת תרבית רקמות 24 בארות	אנונימי	142485
Anti-CD3xCD28 חרוזים	גיבקו	11161ד
X-VIVO 15	לונזה	BE02-060F
סרום אנושי	סיגמא אולדריץ'	H4522	החום מושבת ב-56°C למשך 30 דקות
IL-15	פפרוטק	200-02
IL-2	פפרוטק	200-15
לימפופר	טכנולוגיות תאי גזע	7801
PBS	תרמו פישר	10010023
RPMI 1640	גיבקו-תרמו פישר	61870036
מגנט חרוזי תאי T מגנט DynaMag-2	תרמו פישר	12321ד