זיהוי תת-קבוצות תאי T רגולטוריות מבלוטות לימפה מנקזות לבלב מורין

תקציר

מקור: Luo, Z., et al. קביעת תת-קבוצות תאי T רגולטוריות בבלוטת התימוס של מורין, בלוטת הלימפה המנקזת את הלבלב והטחול באמצעות ציטומטריית זרימה. J. Vis. Exp.(2019)

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאים בודדים מבלוטות לימפה מנקזות לבלב מורין (PDLNs) ואפיון תאי T רגולטוריים (Tregs) מאוכלוסיית התא הבודד באמצעות ציטומטריית זרימה. Tregs מזוהים על סמך הביטוי החיובי של סמני פני התא CD4, CD25 ו-Nrp1, יחד עם גורמי השעתוק הגרעיניים Foxp3 ו-Helios.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בידוד תא בודד מ-PDLN

1. הניחו רשת מתכת סטרילית בגודל 250 מיקרומטר מעל צינור חרוטי בנפח 15 מ"ל בארון תקשורת. שטפו את הרשת עם 1 מ"ל של סל"ד.
2. מעבירים את בלוטות הלימפה לרשת המתכת וטוחנים אותן דרך הרשת באמצעות זוג פינצטה. החל 1 מ"ל של RPMI על רשת מתכת כדי לשטוף את התאים לתוך הצינור. חזרו על הפעולה 3 פעמים נוספות והסירו את הרשת.
3. צנטריפוגה את הצינורות ב 433 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant.
4. להשעות מחדש את גלולת התא בכ 5 מ"ל של RPMI. ממלאים את הצינורות בסל"ד.
5. צנטריפוגה את הצינורות ב 433 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant.
6. להשעות מחדש את גלולת התא בכ 5 מ"ל של RPMI. ממלאים את הצינורות בסל"ד.
7. צנטריפוגה את הצינורות ב 433 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant.
8. להשעות מחדש את גלולת התא ב 2 מ"ל של RPMI. העבר 2 מ"ל של מתלה התא לצינורות תחתונים עגולים של 5 מ"ל עם מכסי מסננת תאים. יש למרוח את מתלה התא על מכסי המסננת של התא.

2. ציטומטריית זרימה

1. צנטריפוגה את מתלי התא מ-PDLNs ב-433 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C. השליכו את הסופר-נטנט.
2. לצבוע את התאים עם נוגדני פני השטח הבאים ב 100 μL של חיץ צביעת ציטומטריה זרימה (מאגר FACS): 0.75 מיקרוגרם / 100 μL נוגדן CD4 מצומד FITC, 0.60 מיקרוגרם / 100 μL נוגדן CD8 מצומד APC-H7, 0.30 מיקרוגרם / 100 μL נוגדן CD25 מצומד PE, 5 μL (1: 20) נוגדן Nrp1 מצומד APC. דוגרים על הצינורות על קרח במשך 40 דקות.
3. הוסף 200 μL של מאגר FACS לכל צינור. צנטריפוגה את הצינורות ב 433 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant. חזור על הפעולה פעם נוספת.
4. לתקן ולחדור את התאים על ידי השעיה מחדש של גלולת התא ב 500 μL של Permeabilization Fixation Buffer (PFB).
   הערה: PFB מוכן על ידי ערבוב 1 חלק של קיבוע / Permeabilization תרכיז עם 3 חלקים של קיבוע / Permeabilization דילול.
5. שמור את הצינורות במקרר ב 4 ° C למשך הלילה.
   הערה: דגירה של שעה אחת גם עובדת.
6. צנטריפוגה את הצינורות ב 433 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant.
7. השהה מחדש את גלולת התא ב 500 μL של חיץ כביסה Permeabilization (PWB). צנטריפוגה את הצינורות ב 433 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את supernatant.
   הערה: PWB מוכן על ידי דילול חיץ חדירות (10x) ל 1:10 במים מזוקקים.
8. לצבוע את התאים עם הנוגדנים התוך-תאיים הבאים ב 100 μL של PWB: 0.30 מיקרוגרם / 100 μL PE-Cy7-conjugated Foxp3 נוגדן, 4 μL (1: 25) PacificBlue-conjugated Helios נוגדן. לדגור את הצינורות על קרח במשך 1 שעה.
9. הוסף 500 μL של PWB לכל צינור. צנטריפוגה את הצינורות ב 433 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant.
10. להשעות מחדש את גלולת התא ב 500 μL של PWB. צנטריפוגה את הצינורות ב 433 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant.
11. השהה מחדש את גלולת התא ב- 300 μL של מאגר FACS.
12. נתח את התאים על ציטומטר זרימה.
13. שער התאים הבודדים בהתבסס על אזור פיזור צדדי, גובה ורוחב, ואזור פיזור קדימה, גובה ורוחב. הפעל מיליון אירועים לניתוח.
14. ייצא את קבצי FCS של ניסויים ונתח אותם באמצעות תוכנת מנתח ציטומטריה זרימה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
RPMI-1640	סיגמא-אולדריץ'	R0883-500ML
eBioscience Foxp3 / ערכת חיץ מכתימת גורם שעתוק	תרמופישר	00-5523-00	מכיל תרכיז קיבוע/חדירה, קיבוע/חדירות, דילול וחיץ חדירות (10x)
מאגר צביעת ציטומטריה של זרימה eBioscience	תרמופישר	00-4222-26
נוגדן חד שבטי CD4 (RM4-5), FITC, eBioscience	תרמופישר	11-0042-85
CD25 נוגדן חד שבטי (PC61.5), PE, eBioscience	תרמופישר	12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 עכבר נגד עכבר CD8a	BD Biosciences	560182
עכבר נוירופילין-1 נוגדן מצומד APC	מערכות מו"פ	FAB5994A
נוגדן חד שבטי FOXP3 (FJK-16s), PE-ציאנין7, eBioscience	תרמופישר	25-5773-82
פסיפיק בלו אנטי-עכבר/נוגדן הליוס אנושי	ביולג'נד	137220
Falcon 5 מ"ל מבחנה פוליסטירן עגול תחתית, עם מכסה הצמדה למסננת תאים	קורנינג	352235	רשת ניילון בגודל 35 מיקרומטר משולבת במכסה ההצמדה בעל המיקום הכפול
צינור 15 מ"ל, 120 מ"מ x17 מ"מ, PP	זארשטדט	62.554.002
ציטומטריית זרימה	ב.ד.
תוכנה לניתוח ציטומטריה של זרימה	Inivai טכנולוגיות	לוגיקת זרימה