$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. התמיינות Megakaryocyte
- זרע 5 × 105 תאים / מ"ל CD34+ תאים ב 2 מ"ל של SFM בתוספת 50 ng / mL רקומביננטי תרומבופויאטין אנושי (rhTPO) לכל באר בצלחת 12 באר. לדגור על תאים ב 37 ° C, 5% CO2 באטמוספירה לחה. אם התאים מתמזגים לפני שהם נדרשים לניתוח, קצרו את התאים ופצלו אותם למספר בארות עם מדיה טרייה ו- rhTPO.
הערה: יש להכין שתיים או שלוש בארות במיוחד כדי לפקח על התמיינות בנקודות זמן שונות (למשל, ימים 7, 9 ו-10).
- קצור תאים מהבארות שהוקצו כדי לפקח על התמיינות מבלי להפריע לתאים בבארות האחרות.
- תאי צביעה עם נוגדן 20 μL anti-GPIIb/CD41-FITC ונוגדן 10 μL anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 בנפח סופי של 100 μL. הגדר צינור בקרה באמצעות נוגדני בקרת האיזוטיפ המתאימים. יש לדגור במשך 15 - 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
- הוסף 1 מ"ל של SB לכביסה. צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 10 דקות. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב 200 - 300 מיקרוליטר של SB. נתח לפי ציטומטריית זרימה.
- עבור כל פלואורופור, נתח את פקדי האיזוטיפ כדי להגדיר את ה- gating עבור FITC ו- Alexa Flour 647 אוכלוסיות חיוביות. נתחו את דגימות התאים המוכתמים כדי לקבוע את אחוז התאים החיוביים הכפולים CD41+/CD42a+, המייצגים MK בוגר (איור 1C).
- להדמיה מיקרוסקופית של סמני פני התא, צביעת תאים כמתואר בסעיף 1.3.
- הוסף 1 מ"ל של SB לכביסה. צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 10 דקות. השהה מחדש את הגלולה ב 100 μL של SB וסובב על מגלשת זכוכית ב 1,000 x גרם במשך 5 דקות. תקן תאים בשקופית על ידי טבילתם במתנול למשך 30 שניות. ייבשו באוויר, הוסיפו 20 מיקרוליטר של מדיית הרכבה המכילה DAPI (ראו טבלת חומרים), כסו באמצעות כיסוי ודמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2A).
- להדמיה של אנטיגנים תוך תאיים, להשעות תאים ב- PBS ולתקן עם paraformaldehyde (ריכוז סופי של 1%) במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לחדור לתאים, הוסיפו טריטון-X 100 (0.1%) ודגרו במשך 15 דקות. יש לשטוף תאים עם 2 מ"ל PBS/0.1% טריטון-X 100. יש להשהות מחדש ב-100 מיקרוליטר של PBS/0.1% טריטון-X 100, להוסיף נוגדנים נגד vWf ונגד CD62p (דילול 1:200), ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- יש לשטוף עם 2 מ"ל PBS/0.1% טריטון-X 100 וצנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 10 דקות, להשהות מחדש ב-100 מיקרוליטר של אותו חוצץ, ולהוסיף נגד עכבר IgG-Alexa 594 ונגד ארנב IgG-Alexa 488 (1:100). יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף עם 2 מ"ל PBS / 0.1% טריטון-X 100, להשהות מחדש ב 100 μL של אותו חוצץ, ולהוסיף 20 μL של anti-CD42b-APC. לאחר מכן סובב את התאים לשקופיות זכוכית כמתואר בשלב 1.6.1 והכן דוגמאות להדמיה מיקרוסקופית כמתואר בשלב 1.6.1.
- לקביעת פלואידים, קצרו תאים בימים 12 או 13 של התמיינות. הוסף 1 מ"ל של SB לכביסה. צנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 10 דקות וכתם עם נוגדן 20 μL anti-GPIIb/CD41-FITC בנפח סופי של 100 μL. דגירה ב-4°C למשך 30 דקות.
- יש לשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל של SB ולהשהות מחדש את הגלולה ב-300 מיקרוליטר של מאגר ציטראט היפוטוני (1.25 מ"מ נתרן ציטראט, 2.5 מ"מ נתרן כלורי, 3.5 מ"מ דקסטרוז) המכיל 20 מיקרוגרם/מ"ל פרופידיום יודיד ו-0.05% טריטון-X 100. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C כשהיא מוגנת מפני אור.
- הוסף RNase לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ"ל ודגור במשך 30 דקות ב 4 ° C מוגן מפני אור. קבע את עוצמת הפרופידיום יודיד על-ידי ציטומטריית זרימה על-ידי איסוף 30,000 עד 50,000 אירועים באוכלוסיית CD41-FITC+ (איור 2C).
2. ספירת טסיות, ספירת טסיות והפעלת טסיות
- קציר תאים (משלב 1.1) בימים 8 או 9 של התמיינות וזרעים ב 1 × 104 תאים / באר בצלחות 48 באר ב 200 μL של SFM טרי בתוספת 50 ng/mL rhTPO. תרבית במשך 5 ימים ב 37 ° C, 5% CO2.
הערה: למטרות כמות, בארות זרעים במשולש. צפיפות נמוכה זו נדרשת להדמיה וספירה של MK נושא טסיות. פרוסטלטים בדרך כלל מתחילים להופיע לאחר יומיים של תרבית. השיא הוא בין ימים 4 ל -5.
- ספרו את מספר ה-MK נושא הטסיות בכל הבאר במיקרוסקופ אור הפוך באמצעות מטרות 10X או 20X.
הערה: שלב מיקרוסקופ מחומם (37 מעלות צלזיוס) עדיף, שכן שמירה על התאים בטמפרטורת החדר לפרקי זמן ממושכים גורמת להתכווצות של שלוחות הטסיות. פרוסטלטים נצפים כהארכות ארוכות מגוף הח"כ. לכל ח"כ יכולות להיות מספר בליטות טסיות. ככל שמתפתחות פרוסטלטים, גופו של הח"כ פוחת בגודלו.
- קצרו תאים וצנטריפוגות בגודל 400 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. תאי צביעה עם נוגדן CD41-FITC אנטי-אנושי 20 μL, כמתואר בשלבים 1.3 ו-1.4. חישוב אחוז MK נושא טסיות (pbMK):
pbMK (%) = [(MKs נושאי טסיות/ באר) / (סה"כ CD41+ תאים/ באר)] x 100
- כדי לספור טסיות ששוחררו למדיום התרבית, ערבבו בעדינות את התאים עם פיפטה של פסטר ואספו 100 מיקרוליטר בימים 14 או 15 של תרבית.
- יש להכתים עם נוגדן CD41-FITC אנטי-אנושי 20 μL למשך 20 - 30 דקות ב-4°C. הגדר צינור בקרה באמצעות נוגדן בקרת האיזוטיפ המתאים.
- הוסף 150 μL של SB ו 50 μL של ספירת חרוזים.
- לניתוח ציטומטרי של זרימה, הגדר את FSC ו- SSC לקנה מידה של יומן. השתמשו בטסיות דם אנושיות רגילות מפלזמה עשירה בטסיות דם המוכתמות ב-CD41-FITC כמתואר בסעיף 2.4.1 כדי להגדיר את הגאטינג לטסיות הדם (איור 3A).
- נתח את טסיות הדם המוכתמות על ידי ספירת חרוזים לפי ציטומטריית זרימה. אספו 1,000 אירועים של ספירת חרוזים באמצעות תרשים פיזור FSC לעומת SSC (איור 3A). חשב את מספר טסיות הדם בהתבסס על אירועים חיוביים CD41-FITC (איור 3B) באמצעות הנוסחה:
טסיות לכל μL=[(מספר אירועים חיוביים CD41-FITC)/1,000 חרוזים)] x [(מספר חרוזים ב-50 מיקרוליטר)/נפח דגימה)]
- כדי לנתח את הפעלת טסיות הדם, מערבבים בעדינות את התאים עם פיפטה פסטר ולאסוף 100 μL בימים 14 או 15 של תרבית. הוסף 1 מ"ל של חיץ Tyrode (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 0.2 mM Na2HPO4, 12 mM NaHCO3, 5.5 mM D-glucose, pH 6.5) וצנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות לתאי כדור.
- אספו את הסופרנאטנט והצנטריפוגה במהירות של 800 x גרם למשך 10 דקות לחלקיקים בגודל טסיות דם.
- השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש ב-100 מיקרוליטר של החיץ של טירוד. יש להוסיף 20 μL של נוגדן PAC1-FITC ואדנוזין דיפוספט (ADP) לריכוז סופי של 20 μM. לדגור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. נתח לפי ציטומטריית זרימה כדי לקבוע את אחוז האירועים החיוביים של FITC. השתמשו בטסיות דם אנושיות טריות שטופלו באותו אופן כמו קבוצת ביקורת חיובית (איור 3C).
