מערכת תרבות תימית תלת-ממדית ליצירת מהגרים תימיים שמקורם ב-iPSC

תקציר

מקור: Vizcardo, R., et al. מערכת תרבית תימית תלת-ממדית ליצירת מהגרים תימיים ספציפיים לתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע שמקורם באנטיגן. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים פרוטוקול ליצירת תאי T פונקציונליים ספציפיים לאנטיגן מתאי T לא בוגרים שמקורם ב-iPSC באמצעות מערכת תרבית תימית תלת-ממדית. תרבית משותפת של תאי T לא בוגרים שמקורם ב-iPSC עם עכברים אנדוגניים מדולדלי לימפוציטים, אונות תימיות עובריות, הביאה להבשלה מוצלחת של תאי T ליצירת CD8αβ+ MHC class I+ iPSC שמקורם במהגרים תימיים (iTEs).

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. 3D תרבית איברים תימית ליצירת iTE

1. לקצור אונות תימיות עובריות של עכברים ולפרוס לימפוציטים אנדוגניים על ידי טיפול deoxyguanosine (dGUO).
2. ביום השביעי של הטיפול ב-dGUO, קח ארבע מנות חדשות בקוטר 10 ס"מ ומלא כל אחת מהן ב-20 מ"ל של מדיה מלאה (Roswell Park Memorial Institute Media 1640 [RPMI 1640] + 10% FBS + 1x L-alanyl-L-גלוטמין + 1x נתרן פירובט + 1x מדיום חיוני מינימלי עם חומצות אמינו לא חיוניות (MEM-NEAA) + 1x פניצילין-סטרפטומיצין + [1:1000] 2-מרקפטו אתנול).
3. מעבירים את כל קרומי הניטרוצלולוז עם האונות התימיות לצלחת אחת של 10 ס"מ. נתקו את האונות הבודדות מהקרום בעזרת מלקחיים, ואפשרו להן להיות שקועות במדיה. השליכו את הממברנות. דגירה במשך שעה אחת ב- RT.
4. מעבירים את האונות התימיות לצלחת חדשה בקוטר 10 ס"מ עם מדיה מלאה ודגרים במשך שעה אחת ב-RT. חזור על שלב זה פעמיים נוספות.
5. בעזרת מלקחיים, מקבעים את האונות התימיות לצלוחית (אחת בכל פעם), וביד השנייה מבצעים חתך בעומק 100-200 מיקרומטר במרכז ומאריכים מחצית מקוטר האונה כדי להקל על נדידת אב תאי T לתוך האונה.
6. מעבירים את האונות התימיות לצלחת חדשה בקוטר 10 ס"מ מלאה באמצעי התמיינות מלא (מדיה מלאה + אינטרלוקין עכבר 5 נ"ג/מ"ל אינטרלוקין-7 (IL-7) + ליגנד Flt3 עכבר 5 נ"ג/מ"ל (FLT3L) + 5 נ"ג/מ"ל גורם תאי גזע (SCF)).
7. לחלופין, אם אתם משתמשים בלוחות תרבית תלת-ממדיים עם רשתות ברמה התחתונה והעליונה, מלאו את שתי הרשתות ב-PBS סטרילי כדי למנוע אידוי וייבוש של הטיפות התלויות.
8. העבירו 30 μL של מדיה שלמה המכילה אונה תימית אחת שטופלה ב-dGuo משלב 1.6 לכל באר של צלחת התרבית התלת-ממדית.
9. אספו תאי שושלת T לא דבקים (תאי T לא בוגרים שמקורם ב-iPSC) מתרבית משותפת OP9/DLL1 (ימים 16-21) והשהו מחדש ב-2-5 x 10³ תאי שושלת T לכל מדיה של 20 μL.
10. הוסף 20 μL של תרחיף תאי שושלת T לכל אונה תימית בלוח התרבית התלת-ממדי. יש לדגור למשך הלילה ב-37°C עם 5% CO₂.
11. כוונו את צינור P200 ל-30 μL ושאפו את המצע לאחר צנרת מספר פעמים מכל באר כדי להסיר את כל התאים המקיפים את האונות התימיות. מחק מדיה והוסף 30 μL של מדיה שלמה. חזור על הליך זה 5-7 פעמים כדי להסיר תאי T לא בשלים נוספים שאינם נודדים לתוך האונות. שנה 25-30 μL של מדיה מדי יום לאחר מכן.
12. אשרו היווצרות הילה של מהגרים תימיים שמקורם ב-iPSC (iTE) סביב האונות החל בימים 4-5 במיקרוסקופ אור.
13. יש לאסוף iTE מדי יום על ידי צנרת מדיה ללא הפרעה לאונה. החליפו מדיה מדי יום והמשיכו באיסוף עד כ-12 יום.
14. iTE שנקטף מוכן לשימוש עבור אנליזות מולקולריות (איור 1, איור 2, איור 3 ואיור 4) או עבור ניסויים בהשתלות in vivo.

תוצאות

איור 1: אימונוהיסטוכימיה של אונות תימיות שנזרעו עם תאי T לא בוגרים שמקורם ב-iPSC. למעלה: צביעת H&E של אונה תימית עם וללא זריעה של תאי T לא בוגרים שמקורם ב-iPSC. מלמעלה למטה: תמונות קונפוקליות של האונות החתוכות מוכתמות ב- DAPI (גרעין), CD3 (תא T) ומיזוג. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-דאוקסיגואנוזין	סיגמא-אולדריץ'	312693-72-4
2-מרקפטואתנול (1,000x)	תרמו פישר סיינטיפיק	21985-023
פ.ב.ס.	ג'מיני	100-500
ליגנד Flt-3	מערכות מו"פ	427-FL
אינטרלוקין-7	מערכות מו"פ	407 מ"ל
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM	גיבקו	11140050
אבקת MEM	גיבקו	61100061
נתרן פירובט	תרמו פישר סיינטיפיק	11360-070
גורם תאי גזע (SCF)	מערכות מו"פ	455 מ"ק
פניצילין/סטרפטומיצין	תרמו פישר סיינטיפיק	15140-122
pH מלוחים חוצצי פוספט 7.4 (1x)	תרמו פישר סיינטיפיק	10010-023
RPMI 1640	גיבקו	11875093
צלחת בקוטר 10 ס"מ	קורנינג, Inc	353003
צלחת טיפה תלויה Perfecta3D	סיגמא-אולדריץ'	HDP1096
מלקחיים	דומונט	0108-5PO
OP9/N-DLL1	מרכז Riken Bioresource	חתול# RCB2927; RRID:CVCL_B220
GlutaMAX (פי 100)	תרמו פישר סיינטיפיק	35050-061