$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. התרחבות תאי NK מרקמות הכבד (יום 0), כפי שמוצג באיור 1.
הערה: מספר התא הראשוני והכדאיות מתואמים מאוד עם הזמן שחלף מאז הסרת האיברים וכמות דגימת הרקמה הראשונית. עם זאת, אם הרקמות ממוקמות ב-30 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) ונשמרות על קרח או במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, עדיין ניתן להרחיב את תאי ה-NK ברמת טוהר גבוהה ובחיוניות עד 24 שעות מאוחר יותר.
- זהה אזורי רקמות קיימא כדי להשיג לימפוציטים מרקמות וחלקים באמצעות ציוד כירורגי סטרילי.
- הכניסו את הרקמות ל-30 מ"ל HBSS (עם סידן או מגנזיום) ושמרו על קרח עד שהן מוכנות להתכונן לבידוד.
- טחנו את הרקמה לקוביות של <0.5 ס"מ באמצעות סכיני גילוח סטריליים או מספריים ומלקחיים בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
- הכינו תמיסת 1x collagenase IV (1 מ"ג/מ"ל) על ידי דילול ציר 10x ב-HBSS (10x Collagenase IV: 10 מ"ג/מ"ל או ~200 U/mL).
- מניחים את חתיכות הרקמה הטחונות בצינורות הדיסוציאטור של הרקמות. מלא את הצינורות עם לא יותר מ 4 גרם של רקמה לטבול את חתיכות הרקמה ~ 10 מ"ל של 1x collagenase IV.
הערה: שימוש ב- DNase I אינו מומלץ מכיוון שהוא עשוי להפחית מעט את הכדאיות והתשואה של NK. אנא עיין בטבלת החומרים עבור צינורות הדיסוציאטור הספציפיים לרקמות שבהם נעשה שימוש.
- הכניסו את צינורות הדיסוציאטור של הרקמה לדיסוציאטור רקמות וערבבו בטמפרטורה של 37°C כדי לטחון את הרקמה ביסודיות.
הערה: עבור רקמת הכבד, זה עשוי לקחת יותר מ -30 דקות. עבור רקמה פריכה יותר, בסביבות 15 דקות עשוי להספיק. אנא עיין בטבלת החומרים עבור צינורות ספציפיים לפירוק רקמות ולדיסוציאטור הרקמה שבו נעשה שימוש.
- הסר את צינורות דיסוציאטור הרקמה ו triturate דרך מסננת תא ניילון 40 מיקרומטר באמצעות הקצה האחורי של מזרק 5 מ"ל. לאסוף את eluent ולהשליך את השברים הגדולים מעוכל.
- סובבו את הנוזל כלפי מטה במהירות של 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופר-נאנט.
- השהה מחדש את כדורי התא בסיליקה מצופה 30% פוליוויניל פירולידון (PVP) כדי להסיר תאי שומן שאחרת יזהמו את מקטע הלימפוציטים הסופי.
- להכנת סיליקה אחת מצופה PVP, יש להשתמש בדילול 9:1 של סיליקה מצופה PVP ב-10x PBS.
הערה: עיין בטבלת החומרים עבור הסיליקה המצופה PVP הספציפית שבה נעשה שימוש.
- להכנת 30% סיליקה מצופה PVP, דללו 1x סיליקה מצופה PVP עם PBS/HBSS.
- סובבו את כדורית התא במהירות של 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופר-נאנט.
- להשעות מחדש את גלולת התא ב 9 מ"ל של R-10 media.
הערה: עיין בטבלת החומרים להרכב המדיה R-10.
- בזהירות שכבה של תרחיף התא מעל 4 מ"ל של Ficoll או לימפוציטים הפרדת מדיה כדי להפריד לימפוציטים מתאי דם אדומים תאים polymorphonuclear cells.
- הפרידו את השכבות על ידי צנטריפוגה במהירות של 400 x גרם למשך 23 דקות בטמפרטורת החדר כאשר ההאצה והבלמים כבויים או במצב הנמוך ביותר. בזהירות decant את השכבה העליונה-בינונית ולקצור את interphase המכיל לימפוציטים חודרים רקמות.
- שטפו את התאים עם 10 מ"ל של מדיה והמשיכו לספירת תאים, ציטומטריית זרימה, aliquoting והקפאה של תאים, או פרוטוקול הרחבת NK ראשוני.
