Ex Vivo התרחבות של תאי הרג טבעיים מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים

תקציר

מקור: Ma, M., et al. הרג טבעי (NK) ושיטת הרחבת תאי CAR-NK באמצעות קו תאי B ממברנה Bound-IL-21-Modified. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים טכניקה להרחבת תאי הרג טבעי (NK) ישירות מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) באמצעות קו תאי הזנה. PBMCs מתורבתים יחד עם תאים מזינים לימפובלסטואידים מהונדסים גנטית המבטאים אינטרלוקין-21 הקשור לקרום (mIL-21), ולתרבית מתווספים הציטוקינים אינטרלוקין-2 (IL-2) ואינטרלוקין-15 (IL-15). יחד, קוקטייל זה של ליגנדות מוביל להתרחבות ממושכת של תאי NK עם טוהר גבוה.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. התרחבות תאי NK מרקמות הכבד (יום 0), כפי שמוצג באיור 1.

הערה: מספר התא הראשוני והכדאיות מתואמים מאוד עם הזמן שחלף מאז הסרת האיברים וכמות דגימת הרקמה הראשונית. עם זאת, אם הרקמות ממוקמות ב-30 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) ונשמרות על קרח או במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, עדיין ניתן להרחיב את תאי ה-NK ברמת טוהר גבוהה ובחיוניות עד 24 שעות מאוחר יותר.

1. זהה אזורי רקמות קיימא כדי להשיג לימפוציטים מרקמות וחלקים באמצעות ציוד כירורגי סטרילי.
2. הכניסו את הרקמות ל-30 מ"ל HBSS (עם סידן או מגנזיום) ושמרו על קרח עד שהן מוכנות להתכונן לבידוד.
3. טחנו את הרקמה לקוביות של <0.5 ס"מ באמצעות סכיני גילוח סטריליים או מספריים ומלקחיים בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
4. הכינו תמיסת 1x collagenase IV (1 מ"ג/מ"ל) על ידי דילול ציר 10x ב-HBSS (10x Collagenase IV: 10 מ"ג/מ"ל או ~200 U/mL).
5. מניחים את חתיכות הרקמה הטחונות בצינורות הדיסוציאטור של הרקמות. מלא את הצינורות עם לא יותר מ 4 גרם של רקמה לטבול את חתיכות הרקמה ~ 10 מ"ל של 1x collagenase IV.
   הערה: שימוש ב- DNase I אינו מומלץ מכיוון שהוא עשוי להפחית מעט את הכדאיות והתשואה של NK. אנא עיין בטבלת החומרים עבור צינורות הדיסוציאטור הספציפיים לרקמות שבהם נעשה שימוש.
6. מניחים את צינורות הדיסוציאטור של הרקמה לתוך דיסוציאטור רקמות ומערבבים בטמפרטורה של 37°C כדי לטחון את הרקמה ביסודיות.
   הערה: עבור רקמת הכבד, זה עשוי לקחת יותר מ -30 דקות. עבור רקמה פריכה יותר, בסביבות 15 דקות עשוי להספיק. אנא עיין בטבלת החומרים עבור צינורות ספציפיים לפירוק רקמות ולדיסוציאטור הרקמה שבו נעשה שימוש.
7. הסר את צינורות דיסוציאטור הרקמה ו triturate דרך מסננת תא ניילון 40 מיקרומטר באמצעות הקצה האחורי של מזרק 5 מ"ל. לאסוף את eluent ולהשליך את השברים הגדולים מעוכל.
8. סובבו את הנוזל כלפי מטה במהירות של 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופר-נאנט.
9. השהה מחדש את כדורי התא בסיליקה מצופה 30% פוליוויניל פירולידון (PVP) כדי להסיר תאי שומן שאחרת יזהמו את מקטע הלימפוציטים הסופי.
   1. להכנת סיליקה אחת מצופה PVP, יש להשתמש בדילול 9:1 של סיליקה מצופה PVP ב-10x PBS.
      הערה: עיין בטבלת החומרים עבור הסיליקה המצופה PVP הספציפית שבה נעשה שימוש.
   2. להכנת 30% סיליקה מצופה PVP, דללו 1x סיליקה מצופה PVP עם PBS/HBSS.
10. סובבו את כדורית התא במהירות של 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופר-נאנט.
11. להשעות מחדש את גלולת התא ב 9 מ"ל של R-10 media.
    הערה: עיין בטבלת החומרים להרכב מדיית R-10
12. בזהירות שכבה של תרחיף התא מעל 4 מ"ל של Ficoll או לימפוציטים הפרדת מדיה כדי להפריד לימפוציטים מתאי דם אדומים תאים polymorphonuclear cells.
13. הפרידו את השכבות על ידי צנטריפוגה במהירות של 400 x גרם למשך 23 דקות בטמפרטורת החדר כאשר ההאצה והבלמים כבויים או במצב הנמוך ביותר. בזהירות decant את השכבה העליונה-בינונית ולקצור את interphase המכיל לימפוציטים חודרים רקמות.
14. שטפו את התאים עם 10 מ"ל של מדיה והמשיכו לספירת תאים, ציטומטריית זרימה, aliquoting והקפאה של תאים, או פרוטוקול הרחבת NK ראשוני.

2. התרחבות ראשונית של תאי NK מ-PBMCs (או CB או רקמות איברים) (יום 0), כפי שמוצג באיור 2.

1. הפשירו את PBMC הקפוא ואת תאי ההזנה הקפואים והמוקרנים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
2. יש לשטוף את ה-PBMC ו-100 תאי 221-mIL-21 המוקרנים באמצעות צנטריפוגה במהירות של 400 x גרם למשך 5 דקות עם 10 מ"ל של מדיה R-10 בנפרד.
3. שמור 1 x 10⁶ תאים של PBMC עבור cytometry זרימה.
   הערה: טוהר תאי ה-NK הראשוני הוא גורם חשוב בחישוב קצב התפשטות תאי ה-NK.
4. להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של מדיה R-10. ספור את התאים באמצעות Trypan Blue.
5. מערבבים 5 x 10⁶ תאים של PBMC עם 10 x 10⁶ תאים של 100 תאי 221-mIL-21 המוקרנים ב- Gy בצלחת מיוחדת בעלת 6 בארות (ראה טבלת חומרים).
6. הוסף 30 מ"ל של חומרי הדפסה מסוג R-10 בתוספת IL-2 אנושי (200 U/mL) ו- IL-15 אנושי (5 ננוגרם/מ"ל) (ראה טבלת חומרים).
7. לדגור על צלחת מיוחדת 6 בארות ב 37 ° C עם 5% CO₂.
8. החלף את המדיה במדיה R-10 בתוספת IL-2 אנושי (200 U/mL) ו- IL-15 אנושי (5 ng/mL) כדי לשמור על תאי NK כל 3-4 ימים.
   הערה: שמור על פחות מ 20 x 10⁶ תאים לכל באר להרחבה נוספת בכל שינוי מדיה. לקבלת הכדאיות הטובה ביותר, ודא שמספר התאים הכולל בכל באר אינו עולה על 100 x 10⁶ תאים.
9. רשום את מספר התא הכולל, הכדאיות ובצע ציטומטריית זרימה כל 3-4 ימים כדי לחשב את קצב התפשטות תאי NK.

תוצאות

איור 1: דיאגרמה של התרחבות תאי NK מדגימות איברים אנושיים מוצקים. בקצרה, דגימות הכבד האנושיות המתקבלות נטחנות לקוביות קטנות לעיכול מכני. לאחר מכן מבודדים תאים מנותקים באמצעות סיליקה מצופה PVP ואמצעי הפרדת לימפוציטים. יתר על כן, תאי NK מורחבים באמצעות פרוטוקול ההתפשטות המתואר באיור 2.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת G-REX 6 בארות	וילסון וולף	80240מ'	להרחבת תאי NK
AF647-מצומד AffiniPure F(ab')2 פרגמנט עז IgG אנטי-אנושי (H+L)	ג'קסון מחקר חיסוני	109-606-088	עבור ציטומטריית זרימה
קולגנאז IV	סיגמא	C4-22-1G	לבידוד TILs
Cryopreserve מדיה	קורנינג	35-010-CV	90%
רכיב: סרום בקר עוברי (FBS)
Cryopreserve מדיה	סיגמא	D2050	10%
רכיב: דימתיל סולפוקסיד (DMSO)
עדינותMACS C-tubes	Miltenyi ביוטק	130-093-237	לבידוד TILs
gentleMACS Octo	Miltenyi ביוטק	הצעת מחיר	לבידוד TILs
תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS - עם סידן או מגנזיום)	תרמופישר	14170120	לבידוד TILs
IL-15 אנושי	פפרוטק	200-15	להרחבת תאי NK
IL-2 אנושי	פפרוטק	200-02	להרחבת תאי NK
תאי הזנה מוקרנים 221-mIL21	נוצר במעבדה של ד"ר דונגפאנג ליו		קפוא בחומר הקפאה
מדיה להפרדת לימפוציטים	קורנינג	25-072-CV	לבידוד TILs
PE שיבוט CD3 אנטי אנושי HIT3a	ביואגדה	300308	עבור ציטומטריית זרימה
PE/Cy7 שיבוט CD56 (NCAM) אנטי-אנושי 5.1H11	ביולג'נד	362509	עבור ציטומטריית זרימה
פרקול	GE שירותי בריאות	17089101	לבידוד TILs
תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs)	מרכז הדם של ניו יורק		מבודד מפלזמה של תורמים בריאים, קפוא במדיה cryopreserve
מדיית R-10	VWR	45000-404
המצרכים: RPMI 1640
מדיית R-10	VWR	45000-304	1%
רכיב: L-גלוטמין
מדיית R-10	VWR	45000-652	1%
רכיב: פניצילין סטרפטומיצין
מדיית R-10	קורנינג	35-010-CV	10%
רכיב: סרום בקר עוברי (FBS)
כחול טריפאן	קורנינג	25-900 סנטל'	לספירת תאים