$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת שקופיות לתאי ראג'י
- הוסף 150 μL של פיברונקטין (100 מיקרוגרם / מ"ל) לכל באר למגלשה של 8 תא מיקרווול (שקופית תא פלסטיק תחתון) ודגר אותה במשך 30 דקות עד שעה אחת ב 37 ° C. מצע הדבקה זה יאפשר קשירה של תאי ראג'י לקרקעית הבאר (שלב 2), יצירת צימודים חיים עם תאי Jurkat (שלב 4) ולכידת מיקרוסקופ בהילוך מהיר (שלב 6), והוא תואם גם לאחר מכן עם קיבוע פרפורמלדהיד אופציונלי (PFA).
הערה: לקיבוע אצטון, השתמש בשקופיות תא תחתון מזכוכית ובפולי-L-ליזין (20 מיקרוגרם/מ"ל) במקום פיברונקטין מכיוון שאצטון ממיס פלסטיק. שקופית תא 8 microwell (1 ס"מ2 טוב, נפח מרבי 300 μL) או שווה ערך הוא פורמט גמיש ומתאים.
- יש לשאוף פיברונקטין באמצעות פיפטה אוטומטית של 200 μL ולשטוף כל באר עם 200 μL של PBS למשך 2 דקות עם ניעור עדין. חזור על שטיפה זו פעם נוספת. ניתן לאחסן את שקופית התא בשלב זה עם PBS למשך 1-2 שבועות ב 4 °C.
2. היצמדות של תאי ראג'י לשקופיות התא ותיוג 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC)
- העברת 10 מ"ל של מפגש (1-2 x 106 תאים / מ"ל) טרום תרבית של תאי ראג'י לצינור 15 מ"ל, V תחתון. מערבבים היטב ומשתמשים ב-10 μL כדי לספור את התאים על תא נויבאואר או שווה ערך.
- צנטריפוגה את התאים הנותרים ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו והשליכו את הסופר-נאנט.
- השהה מחדש בעדינות את כדורית התא בתווך תרבית שלם וחם (RPMI 1640 בתוספת 10% FCS, 2 מ"מ גלוטמין, 10 מ"מ HEPES, 100 U/מ"ל פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין) בריכוז של 106 תאים/מ"ל. השתמש במשוואה המופיעה להלן:
([ ]ראשוני x Vראשוני = [ ]סופי x Vסופי), כאשר [ ]ראשוני מייצג ריכוז תא התחלתי, Vראשוני = נפח התחלתי של השעיית התא, [ ]סופי = ריכוז התא הסופי, Vסופי = נפח סופי של השעיית התא.
הערה: בהתאם לריכוז התאים של התרבית ההתחלתית, ניתן לאסוף יותר תאים מהנדרש, אך חשוב לשמור על התאים הנותרים בתרבית (37 מעלות צלזיוס) עד סוף הניסוי על מנת למנוע בעיות פוטנציאליות (ראה שלב 2.6).
- תייגו תאי ראג'י כדי לאפשר את זיהויים במהלך היווצרות הצמידות הסינפטית. בניסוי זה, תיוג 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) מבוצע בשלב 2.4.2.
- מעבירים את המספר הנדרש של תאי ראג'י בתווך התרבית לצינור של 2 מ"ל. עבור 8 שקופיות תא microwell, סך של 1.6 מ"ל של השעיית התא נדרש (200 μL לכל באר).
- הוסף CMAC לריכוז סופי של 10 מיקרומטר. שמור על התאים בחושך על ידי כיסוי הצינור ברדיד אלומיניום מכיוון ש- CMAC רגיש לאור. 200 μL המכיל 2 x 105 תאי ראג'י נדרשים לכל 1 ס"מ2 באר. לכן, אם 8 בארות צריך להיות מוכן, 1.6 x 106 תאים Raji נדרשים.
הערה: תיוג תאי ראג'י בכחול עוקב תאים (CMAC, עירור UV ופליטה כחולה) מבדיל אותם מתאי Th כאשר נוצרות המצומדות הסינפטיות. צבע זה תואם לקיבוע PFA ואצטון ומאפשר הליכים אימונופלואורסצנטיים נוספים. נסו להימנע מאקספוזיציה קלה. התיוג של תאי ראג'י בבריכה עם CMAC ואחריו השעיה לפני ההיצמדות של תאי ראג'י לשקופיות התא מצופות הפיברונקטין מבטיח תיוג הומוגני של תאי ראג'י עם CMAC בין בארות שונות.
- יש להשהות מחדש תאים מוכתמים ב-CMAC, ולאחר שאיפת ה-PBS בשקופית התא משלב 1.2, להעביר 200 μL של תרחיף התא לכל באר של שקופיות התא מצופות הפיברונקטין שהוכנו בשלבים 1.1-1.2. יש לדגור על מגלשת התא בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 למשך 30 דקות-1 שעות.
הערה: ההדבקה ותיוג CMAC יתרחשו בו-זמנית בשלב זה וזה חוסך זמן. שימו לב שתאי ראג'י ישקעו במהירות ויש לנקוט משנה זהירות כדי לשמור על ריכוז הומוגני בתרחיף התא לפני הזריעה. אין צורך לשטוף CMAC בשלב זה על ידי צנטריפוגה מכיוון ששטיפת CMAC תיעשה בקלות רבה יותר בשלב 2.7 (כאשר תאי ראג'י המסומנים כבר נצמדו לשקופיות התא). מאחר ש-CMAC נמצא בתרחיף התא בעודפות גדולה, הרקע הפלואורסצנטי הכחול גבוה מכדי להבחין בין התאים המוכתמים בכחול. בדוק פלואורסצנטיות CMAC בתא בשלב 2.7 לאחר שטיפת CMAC.
- ודא שתאי ראג'י דבוקים לתחתית הבארות על ידי ניעור עדין של שקופיות התא במיקרוסקופ. ודא שהתאים מציגים רווחים ביניהם ואינם חופפים זה לזה (איור 1, לוח אמצעי). 50-60% ממפגש התאים מתאים.
- אם רוב התאים נצמדים ביעילות לשקופית התא ולא נצפים רווחי תאים, שטפו היטב כל אחד מהם בתווך מלא וחם והשעו מחדש את המדיום עם צינור אוטומטי של 200 μL כדי לנתק עודפי תאים. בדוק את המפגש לאחר כל שלב השעיה.
- אם התאים אינם נצמדים, חזור שוב על שלב ההיצמדות והגדל את זמן ההיצמדות ו/או את מספר התא.
הערה: ניתן לעצור כאן, לדגור על מגלשת התא ב 37 ° C, 5% CO2 לילה (O/N), ולהמשיך עם הפרוטוקול למחרת. אנא אשרו למחרת שתאי ראג'י נשארים דבוקים ומסומנים ב-CMAC באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- שטפו כל באר בזהירות עם תוספת סל"ד חמה כדי לסלק עודפי CMAC ובדקו אם יש פליטה כחולה במיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1).
הערה: כדי להימנע משימוש בשמן טבילה (דביק וצמיגי) וביעדי שמן עם צמצם מספרי גבוה, ניתן להשתמש במטרות למרחקים ארוכים במיוחד (כלומר, 20x או 40x) כדי לבדוק במהירות את תיוג CMAC באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
3. דופק של CMAC — תאי ראג'י מסומנים עם אנטרוטוקסין סטפילוקוקלי E
- הוסף Staphylococcal Enterotoxin E (SEE, 1 מיקרוגרם / מ"ל) לכל באר. ניתן לדלל את SEE בנוחות בתווך תרבית תאים (תמיסה עובדת ב-100 מיקרוגרם/מ"ל) מהמלאי הקפוא של SEE (1 מ"ג/מ"ל ב-PBS). השתמש 2 μL של פתרון עבודה 100x לכל 200 μL microwell.
אזהרה: יש להשתמש בכפפות בשלב זה ולהשליך את החוד המשומש לקופסת הסיכון הביולוגי.
- יש לדגור על מגלשת התא בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 למשך 30 דקות לפחות. אפקט SEE נמשך לפחות 3-4 שעות.
הערה: ניתן להוסיף את SEE לבארות בנקודות זמן שונות בעת הצורך, אם מתוכננות הגדרות נפרדות של קיטועי זמן (שלב 5) ו/או בהתאם לנקודת זמן ההתחלה של ניסויי נקודת הקצה (שלב 6).
4. הכנת תאי Jurkat
- השתמש בתרבית שגדלה בעבר של תאי Jurkat (1-2 x 10,6 תאים/מ"ל) עבור ניסוי זה. השתמש בתאים מבקבוק תרבית סטנדרטית או מטרנספקציה קודמת בהתאם לפרוטוקולי אלקטרופורציה סטנדרטיים, כפי שתואר קודם לכן. הטרנספקציה של תאי Jurkat תאפשר הדמיה בהילוך מהיר של התנועה של גרגירים מפרישים בתאים חיים. לדוגמה, כאשר GFP-CD63 (סמן של MVB) מבוטא, ניתן להקליט את התנועה של שלפוחיות מעוטרות GFP-CD63.
- התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. אם נצפה עודף של תאים מתים (>20-30%), בצע צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות Ficoll באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים, כדי לחסל את עודף התאים המתים (תאים מתים מפגינים צפיפות גבוהה יותר מתאים חיים) לפני השימוש (ראה דיון).
- מעבירים את התאים לצינור של 15 מ"ל, צינור תחתון V, ומשתמשים ב-10 μL לספירה באמצעות המוציטומטר.
- צנטריפוגה של התאים הנותרים כמתואר בשלב 2.2. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים באותו ריכוז כמו תאי ראג'י (1 x 106/mL) באמצעות מדיום תרבית טרי וחם. בצע את שלבים 2.2-2.3.
- שמור על תאי Jurkat בתרבית (37 ° C, 5% CO2) בזמן ההמתנה לשלב 4.
הערה: באפשרות השנייה (טרנספקציה), מספר התאים החיים יהיה נמוך בהרבה מאשר בראשון. לכן, שקול להשתמש בנפח תרבית תאים התחלתי גבוה יותר כדי שיהיו מספיק תאים לניסוי. מ 10 x 106 תאי Jurkat לכל קובטת אלקטרופורציה וטרנספקציה, רק 2-4 x 106 תאי Jurkat ישרדו לאחר 48 שעות של transfection וחלק תאים אלה יאבדו במהלך שלב Ficoll. לפיכך, קובטת אלקטרופורציה אחת מספיקה בדרך כלל כדי לאתגר את תאי הראג'י המודבקים בפולסי SEE מ-8 מיקרו-בארות (דרושים 1.6 x 106 תאי יורקאט נגועים).
5. זריעה משותפת של תאי ראג'י ויורקאט
- קח את שקופיות התא המכילות את תאי הראג'י המסומנים ב- CMAC, SEE-pulsed, מודבקים מתוך האינקובטור משלב 3.2. אין צורך לשטוף את CMAC בשלב זה מאז זה נעשה בעבר בשלב 2.7.
- שאפו בזהירות את מדיום התרבית של כל באר, אחד אחד, מפינה אחת של הבאר באמצעות פיפטה אוטומטית של 200 מיקרוליטר. אל תתנו למדיום שבבאר להתייבש לחלוטין.
- מיד להחליף את המדיום עם 200 μL של תאי Jurkat resuspended בתווך תרבית התא (1 x 106/mL) מוכן בשלב 4.5. אם מבוצעת הדמיה בהילוך מהיר, עבור לשלב 6 מיד לאחר שלב זה, שכן תאי Jurkat נוטים למשקעים וליצור מצומדות סינפטיות מהר מאוד. מטעמי נוחות, המיקרו-בארות המכילות תאי ראג'י מודבקים בפולסי SEE, שאינם מקבלים זריעה עם תאי Jurkat בשלב זה, צריכות להישמר עם מדיום תרבית תאים עד לאתגר הבא עם תאי Jurkat. זה יאפשר באופן גמיש אתגרים עתידיים עם תאי Jurkat לגישות ניסיוניות נוספות של קיטועי זמן או היפוך קינטיות, נקודת קצה.
- אם עומד להתבצע קיטועי זמן, המשך במהירות לשלב 6. זה כרוך בתרבית משותפת במשך 1-2 שעות על אינקובטור שלב המיקרוסקופ או שווה ערך ב 37 ° C, 5% CO2 כדי לאפשר היווצרות מצומדת סינפטית ורכישת תמונה בו זמנית. אם ניתוח נקודות הקצה, אך לא בחלוף זמן, צפוי לבדוק היווצרות מצומדת לאחר תקופת התרבית המשותפת באמצעות המיקרוסקופ (כמו באיור 1) לפני קיבוע התאים.
6. הדמיה בהילוך מהיר של מצומדות סינפטיות מתפתחות
- הכינו את המיקרוסקופ ואת תא הדגירה לפני ההדמיה. לדוגמה, הגדרות המיקרוסקופ המפורטות מוצגות באיור 2.
הערה: אם מתוכנן ניסוי בהילוך מהיר, יש להכין את כל הגדרות המיקרוסקופ והמשלימים (תא תרבית תאי סביבה וכו') לפני הוספת מתלה Jurkat למגלשת התא עם תאי ראג'י מודבקים. השלבים הבאים מתוארים עבור מיקרוסקופ מסחרי (טבלה של חומרים). עם זאת, ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד באינקובטור תרבית תאים.
- השתמש במיקרוסקופ עם טבילת שמן פי 60, וצמצם מספרי גבוה בעת הדמיה של תנועה מקוטבת.
- ודא שמערכת המיקוד האוטומטית מופעלת וכוונן את ההיסט כדי למקד את תאי הראג'י הקשורים למשטח התחתון. עיין באיור 1.
- לאחר הוספת Jurkat לכל באר המכילה את תאי Raji הדבוקים בשלב 5.3, אתר במהירות את שקופית תא המיקרווול על אינקובטור שלב המיקרוסקופ שחומם מראש (1-2 שעות) (כלומר, OKOlab) ובחר כמה מיקומי XY עם המיקרוסקופ, שדות שבהם סביר להניח לרשום היווצרות IS מתפתחת שנעשתה על ידי, למשל, תא נגוע Jurkat-transfected נופל לתוך מוקד המיקרוסקופ.
- השתמש באינקובטור שלב מיקרוסקופ שחומם מראש מכיוון שנצפה כי שלב מיוצב טמפרטורה שומר על עמדות X, Y, Z יציבות. קריטריונים לשדה XY נוח הם: תאי Raji ממוקדים היטב ולא מתכנסים (כלומר, הצגת רווחים בין תאים) ונוכחות של תאי Jurkat נגועים (ניתן לבדוק זאת על ידי שילוב של שידור ותעלות UV או GFP). תאי יורקאט ישקעו מהר מאוד (כמה דקות) בשקופית התא, והסיכוי לדמיין סינפסות מתפתחות יקטן עם הזמן (איור 1). ניתן לסיים את הניסוי לאחר קיטוע הזמן שהוגדר או להמשיך לשלב 7 ולתקן את המצומדים עבור immunofluorescence וניתוחים הבאים.
הערה: ניתן לבחור עד 16 שדות מיקרוסקופ שונים מעד 4 מיקרו-בארות שונות לרכישה סימולטנית של קיטועי זמן מרובי בארות ברזולוציה הטמפורלית המתאימה (1-2 דקות לכל מסגרת). המגבלה מסתמכת הן על המספר והן על העוצמה (המשפיעה על אקספוזיציית המצלמה) של הפלואורוכרומים השונים שיש לצלם (תלוי במספר החלבונים הפלואורסצנטיים המבוטאים, מלבד CMAC). דרך אחת להגביר את קצב הפריימים היא הקלטה עבור ערוץ CMAC רק באחת מכל מסגרת זמן "n" עבור GFP (כלומר, n = 8, כפי שמוצג באיור 2) מאחר שתאי ראג'י דבוקים לתחתית הבאר ואינם נעים בקלות כתאי יורקאט. בנוסף, זה מועיל ליכולת הקיום של התא, שכן חשיפה תכופה לאור UV עלולה לפגוע בתאים. נסו להתאים את קצב מסגרות הזמן לפריים אחד כל דקה או פחות (כלומר, 20 שניות לפריים, איור 2) מאחר שהקיטוב של MVB לוקח כמה דקות עד שעות להשלים. יש צורך במיקרוסקופ המצויד בצריח אפי-פלואורסצנטי ממונע ובמסנני פלואורסצנטיות מתאימים או שווה ערך לביצוע לכידה רב-ערוצית זו.
