זיהוי סמן CD של תאי הרג המושרים על ידי ציטוקינים אנושיים על ידי ציטומטריה של זרימה

תקציר

מקור: Hsiao, C. H., et al. בידוד והרחבה של תאי T רוצחים ציטוטוקסיים הנגרמים על ידי ציטוקינים לטיפול בסרטן. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה אנו מדגימים טכניקה מבוססת ציטומטריית זרימה כדי לקבוע את חלקם של תאי T רוצחים הנגרמים על ידי ציטוקינים, תאי CIK, שהורחבו מתרבית תאים חד-גרעיניים היקפית בדם.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. אינדוקציה והרחבה של CIK

1. ביום 0, תרבית את PBMCs (1 x 10⁶) בתווך בסיסי טרי המכיל 1,000 IU/mL של IFN-γ במשך 24 שעות באינקובטור תרבית תאים לח ב 37 ° C ו 5% CO₂.
2. ביום הראשון, רעננו את המדיום עם מדיום בסיסי טרי המכיל 50 ng/mL של נוגדן נגד CD3, 1 ng/mL של rh IL-1α, ו-1,000 U/mL של rh IL-2. רענן את המדיום כל 3 ימים.
3. ביום השביעי, רענן את המדיום עם מדיום בסיסי טרי המכיל 1,000 U/mL של rh IL-2. רענן את המדיום כל 3 ימים עד סוף התרחבות התא (יום 14).

2. אימונופנוטיפ להערכת תאי CIK

1. לשטוף את תאי CIK עם 10 מ"ל של PBS סטרילי. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 x גרם ו 18-20 ° C, שואפים supernatant ו resuspend את התאים עם 10 מ"ל של PBS. ספור את מספר התא ובדוק את כדאיות התא באמצעות בדיקת אי ההכללה הכחולה של trypan.
2. Aliquot תאי CIK לתוך שישה צינורות סטריליים 1.5 מ"ל בצפיפות של ~ 5-10 x 10⁵ תאים / מ"ל PBS. תווית וטיפול כדלקמן: צינור 1, ריק (ללא נוגדן); צינור 2, להוסיף 20 μL של איזוטיפ IgG1-FITC; צינור 3, להוסיף 20 μL של איזוטיפ IgG1-APC mAbs; צינור 4, להוסיף 20 μL של CD3-FITC; צינור 5, להוסיף 20 μL של CD56-APC mAbs; וצינור 6, להוסיף 20 μL של CD3-FITC ו 20 μL של CD56-APC mAbs.
3. ערבבו בעדינות את תאי ה-CIK עם הנוגדנים על ידי הדבקתם בעדינות מעלה ומטה לפחות פי 3 עם פיפטה סטרילית בנפח 1 מ"ל, ולאחר מכן דגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
4. צנטריפוגה את הצינורות במשך 10 דקות ב 300 x גרם ו 18-20 ° C. לשאוף את supernatant ולהשעות את גלולת התא פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS. בעדינות פיפטה אותם למעלה ולמטה לפחות 3x עם פיפטה סטרילית 1 מ"ל.
5. חזור על שלב 2.4.
6. השאירו את הצינורות בחושך לפני ניתוח ציטומטרי זרימה.

3. זיהוי סמן תקליטור

1. מעבירים את מתלה התא לצינור תחתון עגול סטרילי מפוליסטירן בנפח 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים (רשת של 100 מיקרומטר) על ידי פיפטוף עדין דרך הפקק. שים את הצינורות על הקרוסלה בסדר.
2. פתח את התוכנה לניתוח ציטומטריית זרימה וצור תיקיית ניסוי. לחץ על הלחצן New Specimen כדי להוסיף דגימה וצינור לניסוי ולתת שמות לשפופרות באופן הבא: Tube 1, Blank; צינור 2, איזוטיפ IgG1-CD3; צינור 3, איזוטיפ IgG1-CD56; צינור 4, CD3; צינור 5, CD56; צינור 6, CD3CD56.
3. יצירת מערכת פיזור עבור אוכלוסיות תאי CIK (איור 1A).
   1. בחר Tube 1 (ריק) ולחץ על Dot Plot כפתור ליצירת תרשים FSC-A/SSC-A. צייר שער מלבן מעל כל אוכלוסיית התאים עם סף FSC-A >5 x 10⁴ כדי לא לכלול פסולת תאים.
   2. בחר בפרמטר SSC-A/SSC-H עבור התוויית הנקודות החדשה וצייר שער מצולע מסביב לכל התאים הבודדים. בחר את הפרמטרים Count/FITC (CD3) ו- Count/APC (CD56) עבור תרשים ההיסטוגרמה החדש, בהתאמה. בחר את הפרמטר FITC (CD3)/APC (CD56) עבור תרשים הנקודות החדש וצייר שער של ארבעה רבעים כדי להגדיר את ארבע תת-האוכלוסיות.
   3. רשום את הנתונים מ- 20,000 תאים בודדים בכל דגימה. לחץ על לחצן טען דוגמה כדי לנתח תחילה את דוגמת הפקד הריק. זהה את כל אוכלוסיית תאי CIK באמצעות הפרמטרים CD56 ו- CD3 ערוצים.
4. חזור על שלב 3.3 לחקירת כל הדגימות.
5. פתח את הקבצים המכילים את הערכים הסטטיסטיים של הדגימה הבודדת כדי לנתח אוכלוסיות תאי CIK ולהדפיס אותם מחדש בקובצי ניתוח.

תוצאות

איור 1: חלקם של תאי T CD3⁺CD56⁺ ממדגם PBMC מייצג.(A) לימפוציטים זוהו לפי גודל וגרעיניות ספציפיים. אוכלוסייה נבחרת של תא בודד לניתוח לפי ציטומטריית זרימה. (B) ניתוח סטטיסטי של יעילות הרחבת CIK משלושה תורמים בריאים נערך באמצעות מבחן t (*, p < 0.01).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עכבר APC נוגדן CD56 אנטי אנושי	ב.ד.	555518	B159
עכבר APC IgG1, κ בקרת איזוטיפ	ב.ד.	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II ציטומטר זרימה	ב.ד.	338962	ס: R33896202856
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12	הייקלון	SH30023.02	מדיום בסיסי לתרבית תאים OC-3
סרום בקר עוברי	הייקלון	SH30084.03	עבור תרבית תאים K562 ו-OC-3. מדיום מלא מכיל 10% של FBS
פיקול-פאק פלוס	GE Healthcare מדעי החיים	71101700-EK	פתרון שיפוע צפיפות
עכבר FITC נוגדן CD3 אנטי אנושי	ב.ד.	555332	UCHT1
עכבר FITC IgG1, κ בקרת איזוטיפ	ב.ד.	555748	MOPC-21
אנושי אנטי CD3 mAb	TaKaRa	T210	OKT3 הוסף 2.5 מ"ל של מלאי (1 מ"ג / 1 מ"ל) ל 50 מ"ל של מדיום אינדוקציה. מלאי אחסון ב -80°C
RPMI1640 בינוני	גיבקו	11875-085	מדיום בסיסי לתרבית תאים K562. מלאי אחסון ב-4°C