$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. העברה מאמצת של תאי T CD8+ ספציפיים אנטיגניים בעכברים
- בודד אובאלבומין (OVA)-ספציפי CD8+ תאי T (OTI) המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (OTI-GFP) או חלבון פלואורסצנטי אדום (OTI-RFP) מתרחיף בלוטות הלימפה של עכברים טרנסגניים קולטן תאי T באמצעות ערכת בידוד תאי T CD8+ עכבר בהתאם להוראות הייצור. הכן את השעיית התא על ידי ריסוק בלוטות הלימפה באמצעות בוכנה מזרק, כפי שתואר קודם לכן.
- העברת תאי OTI-GFP או OTI-RFP (3 x 106 תאים) למקבלי עכברי בר C57BL/6 על ידי הזרקה תוך ורידית כמתואר על ידי Cahalan, et al. השתמש בעכברים שהם בדרך כלל 6-12 שבועות של גיל.
הערה: שלב זה הוא אופציונלי ונדרש רק למעקב אחר תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן.
2. ליסטריה מונוציטוגנים זיהום
- הרחיבו את L. monocytogenes מהונדסים גנטית כדי לבטא OVA (LM-OVA) לשלב אקספוננציאלי של צמיחה בעירוי לב מרק ב 37 °C תחת תסיסה עדינה עד OD600 מגיע 0.08-0.1, כפי שתואר קודם לכן.
- הזריקו 100 μL (נפח מרבי = 200 μL) של 0.1–0.5 LD50 LM-OVA מדולל במי מלח חוצצי פוספט (PBS) על ידי הזרקה תוך ורידית באמצעות מזרק אינסולין 29 G, לעכברי C57BL/6 מקבלי תאי בר הנושאים תאי OTI-GFP או OTI-RFP כאשר צוין.
הערה: בידינו, 0.1 x LD50 LM-OVA מתאים 2 x 104 יחידות יוצרות מושבה (CFU). מונוציטוגנים מהונדסים גנטית כדי לבטא OVA משמשים להפעלת תאי OTI CD8+ T שהועברו בעבר, אך ניתן להשתמש בזנים אחרים של מונוציטוגנים L.
3. טיפול בברפלדין A (BFA) לחסימת הפרשת ציטוקינים
- הזריקו 250 מיקרוגרם BFA ב-200 מיקרוליטר של PBS תוך צפקית במשך 6 שעות לפני הקרבת עכבר באמצעות מזרק אינסולין 29 גרם.
הערה: BFA Lyophilized הוא הראשון resuspended ב dimethyl sulfoxide (DMSO) כדי להכין מלאי של 25 מ"ג / מ"ל ריכוז. לאחר מכן BFA מדולל ב-PBS בטמפרטורת החדר (RT) כדי למנוע התגבשות לפני ההזרקה. עיכוב הפרשת ציטוקינים גורם להצטברות של IFNγ בתאים. זה חיוני לזיהוי ציטוקינים.
4. קציר הטחול
- הרדימו את העכברים באמצעות עלייה בריכוזים שלCO2 ולאחר מכן פריקת צוואר הרחם.
הערה: פעל בהתאם להנחיות המוסד המקומי להמתת חסד הומנית של עכברים.
- לנקות את הבטן עם 70% אתנול, ולעשות חתך עם מספריים לעשות חתך 1-2 ס"מ דרך העור בצד שמאל של העכבר, שם הטחול ממוקם. בזהירות לעשות חתך בצפק לחשוף את הטחול ולהוציא אותו עם פינצטה. לקצור את הטחול, נזהר לא לסחוט אותו עם מלקחיים או לחתוך אותו כדי למנוע הפרעה לארכיטקטורה הטחול.
5. קיבוע הטחול עם Paraformaldehyde (PFA)
- הכן את הפתרון המקבע על ידי ערבוב 3.75 מ"ל של PBS ו 3.75 מ"ל של 0.2 M L-ליזין. מוסיפים 21 מ"ג נתרן m-periodate ומערבבים היטב. לאחר מכן להוסיף 2.5 מ"ל של 4% PFA ו 20 μL של 12 N NaOH.
הערה: השתמש בתמיסה המקובעת באותו יום והשלך את העודף. אל תאחסן אותו. שלב קיבוע זה חשוב אם הדגימה מכילה חלבונים פלואורסצנטיים כגון GFP. אין להשתמש ב-PFA המכיל עקבות מתנול, שכן הוא מנטרל חלבונים פלואורסצנטיים.
זהירות: PFA הוא רעיל ויש לטפל בו בזהירות.
- יש לטבול את הטחול בקיבוע ולקבע למשך 4 שעות לפחות, בדרך כלל 16-20 שעות ב-4 מעלות צלזיוס תחת תסיסה עדינה.
- השליכו את התמיסה המקבעת והוסיפו 5 מ"ל PBS למשך 5 דקות ב-RT תחת תסיסה עדינה.
- החלף את PBS עם 5 מ"ל של PBS טרי ודגר במשך 1 שעה ב 4 ° C תחת תסיסה עדינה.
- החלף את PBS עם 5 מ"ל של 30% סוכרוז, ולדגור עבור 12-24 h.
הערה: שיטה זו מסייעת לשמור על מורפולוגיה של רקמות. לאחר הדגירה עם תמיסת סוכרוז, האיבר צריך לשקוע בתחתית הבאר.
6. הקפאה וחתך
- שים קרח יבש בכלי קיבול גדול ומניחים בתוכו כלי קיבול קטן יותר המכיל כ -50 מ"ל מתנול טהור וכמה חתיכות קרח יבש.
- יבשו בעדינות את הטחול עם מגבון ללא מוך.
- מניחים את הטחול בתוך תבנית בסיס המכילה טיפה של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בתחתית. היזהרו לא לייצר בועות. מוסיפים OCT על הטחול.
- בעזרת מלקחיים, הפקידו את תבנית הבסיס על פני השטח של המתנול, וודאו שהוא אינו נוגע ב- OCT. הקפאת הרקמה במהירות האפשרית כדי למזער את הממצאים.
- כאשר הוא מוקפא, המשך עם sectioning.
הערה: טחול קפוא ניתן לשמור ב -80 ° C במשך מספר חודשים.
- חתכו את הרקמה באמצעות קריו-מיקרוטום.
- הגדר את טמפרטורת התא על ההקפאה ל -21 °C. חותכים חלקים בעובי הרצוי (בדרך כלל סביב 10 מיקרומטר). פרוטוקול זה עובד עם עוביים של עד 30 מיקרומטר.
- אספו מקטעים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית (ראו טבלת חומרים) ובדקו ויזואלית.
הערה: חלקים ניתן לשמור ב -80 ° C במשך מספר חודשים.
7. צביעה אימונופלואורסצנטית
- אפשר למקטע להגיע ל- RT.
- צייר עיגול עם חוסם נוזלים (למשל, עט PAP) סביב אזור הרקמה. ציירו מחוץ ל-OCT או שזה לא יידבק.
- לאחר שהוא התייבש, יש לייבש את הדגימה על ידי הנחת PBS על קטע הרקמה למשך 5 דקות.
הערה: עוצמת הקול המופעלת על המקטע תלויה בגודל המקטע. בדרך כלל אנו משתמשים ב-100-300 μL. אין לתת לחלקים להתייבש ברגע שהם מיובשים.
- יש לשטוף עם PBS לפחות פעמיים כדי לוודא שהמקטע מוצמד היטב לשקופית.
- הוסף פתרון חסימה לסעיף כדי להקטין את הקישור הלא ספציפי של נוגדנים.
- הכן פתרון חסימה כדלקמן: PBS עם 0.1% Triton X100, 2% סרום עגל עובר (FCS), חוסם קולטן Fc 2.5 מיקרוגרם / מ"ל (CD16/32 נגד עכבר). לאחר מכן להוסיף 2-5% סרום נורמלי של המינים של כל נוגדן משני של לוח הצביעה.
הערה: אם הנוגדנים מצומדים ישירות/ביוטינילציה, יש להוסיף 5% סרום תקין של המינים של כל נוגדן ראשוני. אם נוגדן ראשוני ואחד הנוגדנים המשניים הם מאותו מין (למשל, נוגדן ראשוני שגדל בארנב וארנב משני נגד חולדה), אל תשתמש במין הסרום הרגיל מכיוון שהוא יגביר את אות הרקע.
- הסר בעדינות את PBS מהקטע לפי שאיפה והוסף 100 μL של תמיסת החסימה לכל קטע דגימה. יש לדגור בתא רטוב מכוסה למשך שעה לפחות ב-RT.
- כתם עם נוגדנים ראשוניים.
- לדלל את הנוגדנים הראשוניים בריכוז האופטימלי בתמיסת החסימה. ריכוז הנוגדנים בנקודת המוצא הכללית הוא 5 מיקרוגרם/מ"ל, אך יש להתאים אותו לכל נוגדן ורקמה.
הערה: אם הנוגדנים מצומדים ישירות, צנטריפוגו את תערובת הנוגדנים ב 17.135 x גרם (13.500 סל"ד) במשך 15 דקות ב 4 ° C לפני השימוש בו. פלואורופורים יכולים לזרז. שלב זה ישחרר את המשקעים ובכך ימנע תצהיר לא ספציפי של הנוגדנים המואצים בשקופית.
- החלף את תמיסת החסימה בתמהיל הנוגדנים העיקרי עבור כל דגימה.
- יש לדגור במשך 4 שעות ב-RT או למשך הלילה (OVN) ב-4 מעלות צלזיוס בתא רטוב מכוסה.
- בצע שטיפה.
- הכן את מאגר הכביסה על ידי הוספת 2% FCS ל- PBS.
- שטפו 4 פעמים עם מאגר שטיפה: אחת מהירה (ללא דגירה), אחת למשך 10 דקות ושתיים למשך 5 דקות. לאחר מכן בצע שטיפה סופית עם PBS במשך 5 דקות.
- כתמים עם נוגדנים משניים.
- לדלל את הנוגדנים המשניים של עניין בריכוז אופטימלי בתמיסת החסימה. צנטריפוגה את התערובת, כפי שמתואר עבור הנוגדנים הראשוניים.
- הסירו את תמיסת הכביסה הסופית. מוסיפים את תערובת הנוגדנים המשנית על גבי החלק ודגרים במשך 1-4 שעות ב- RT בתא רטוב מכוסה.
- שטפו 4 פעמים עם מאגר שטיפה: אחת מהירה (ללא דגירה), אחת למשך 10 דקות ושתיים למשך 5 דקות. לאחר מכן בצע שטיפה סופית עם PBS במשך 5 דקות.
- הסירו את תמיסת הכביסה הסופית. אפשרו ל-PBS להתאדות אך אל תייבשו יתר על המידה את המקטע. הניחו טיפה ממדיום ההרכבה על גבי הדגימה והניחו בזהירות את זכוכית הכיסוי מעליה. מדיום ההרכבה חייב לשחזר את כל הקטע. תן לו פולימראז OVN ב RT מוגן מפני light.
הערה: צייר עיגול מסביב למקטע בצד האחורי של השקופית לפני החלת אמצעי ההרכבה. לאחר יישום אמצעי ההרכבה, הרקמה עלולה להיות קשה לראות.
- אחסן את השקופיות בחושך בטמפרטורה של 4°C עד שהן מוכנות לתמונה.
8. הדמיה ואנליזה
- בצע את ההדמיה של הצביעה במיקרוסקופ קונפוקלי.
הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר ספקטרלי הפוך (ראה טבלת חומרים), יחד עם המטרות 10x/NA 0.40 או 60x/NA 1.4 (לניתוח לוקליזציה תת-תאית של ציטוקינים). אורכי גל של עירור ופליטה מוצגים עבור כל חלבון פלואורופור וחלבון פלואורסצנטי בטבלת החומרים.
- בצע ניתוח וכימות כנדרש באמצעות תוכנת עיבוד תמונה (למשל, Imaris או פיג'י).