טיהור והפעלה של טסיות דם מדם שלם

תקציר

מקור: Narciso, M. G., et al. טיהור טסיות הדם מדם עכברים. J. Vis. Exp. (2019).

בסרטון זה, אנו מתארים פרוטוקול לטיהור טסיות דם מדם שלם מורין והפעלתן לאחר מכן עם טרומבין אגוניסט טסיות. כאשר מנתחים אותם באמצעות ציטומטריית זרימה, טסיות המנוחה המטוהרות מאופיינות על סמך הביטוי של סמן פני השטח של התא CD41, בעוד שטסיות מופעלות מטוהרות מבטאות יחד את סמני פני השטח CD41 ו- CD62P.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. טיהור טסיות

הערה: טיהור טסיות צריך להתבצע בטמפרטורת החדר כדי למנוע את השפלתן. ודא כי הטמפרטורה של ריאגנטים ומכשירים הוא בין 18 ל 22 ° C. כדי למנוע השפלת טסיות, יש להימנע מפיפטינג מהיר ורעד נמרץ במהלך ההליך.

1. הוסף 600 μL של iohexol gradient medium (12% אבקת iohexol ב 0.85% נתרן כלורי, 5 mM טריצין, pH 7.2) לתוך צינור 1.5 מ"ל.
2. הוסיפו 200 מיקרוליטר של דגימת דם באיטיות במורד הצד של הצינור על גבי המדיום ההדרגתי עם קצה פיפטה רחב משעמם, כך שדם ומדיום יוהקסול לא יתערבבו (איור 1A).
3. צנטריפוגה הדגימה המכילה צינור ב 400 x גרם במשך 20 דקות ב 20 ° C ברוטור דלי מתנדנד עם האצה איטית והאטה.
4. אספו את רוב השכבה העשירה בטסיות הדם וחלק קטן מהשכבה הענייה בטסיות הדם (סה"כ 300 עד 400 מיקרוליטר) באמצעות קצה פיפטה רחב ללא הפרעה לשכבות RBC ו-WBC (איור 1B). העבר את דגימת הטסיות לצינור חדש.
   הערה: אם ספירת הטסיות נמוכה יותר בדם או משתמשים בנפח דם קטן יותר, ניתן לראות את השכבה העשירה בטסיות ואת השכבה הענייה בטסיות כשכבה אחת.
5. הוסף 1 מ"ל PBS לדגימת הטסיות, ערבב על ידי היפוך, וצנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 10 דקות ב 20 ° C ברוטור דלי מתנדנד. יש להשליך את התמיסה לחלוטין ולהוסיף 200 μL של PBS כדי להשעות מחדש את הטסיות עם pipetting עדין.
   הערה: שלב זה הוא אופציונלי, שכן הוא מסיר את המדיום ההדרגתי ואת חלבוני פלזמה ומגביר את הרגישות של טסיות הדם אגוניסטים כגון טרומבין. מכיוון שלצנטריפוגות שונות יש תוכניות שונות, ניתן לקבוע את התאוצה/ההאטה האיטית על ידי קריאת המדריך למשתמש של הצנטריפוגה.
6. העבר 30 μL של דגימה זו לתוך צינור חדש כדי לספור טסיות. שאר הטסיות יכולות לשמש לבדיקות ביוכימיות ופיזיולוגיות כגון הפעלת טסיות, צבירה, שחרור גרגירים וכו '.
7. עבור RNA או מיצוי חלבון, צנטריפוגה את דגימת טסיות ב 800 x גרם במשך 10 דקות כדי לגלול את טסיות. השליכו את הסופרנאטנט לחלוטין מבלי להפריע לכדור. הוסף את הנפח הרצוי של RNA או חיץ ליזה חלבון כדי lyse טסיות.

2. הפעלת טסיות

1. בצינור, הוסף 1 עד 2 מיליון טסיות מטוהרות בעד 100 μL של חיץ צביעה (PBS עם 2% סרום בקר עוברי, FBS).
2. עבור מספר רב של דגימות, הכינו תערובת אב של נוגדנים עם 1 μL (0.5 מ"ג/מ"ל) מהבאים: PE-Cy7 חולדה נגד עכבר TER 119, PE חולדה נגד עכבר CD45, FITC חולדה נגד עכבר CD41, וחולדה APC נגד עכבר / CD62P אנושי (P-selectin) כדי לזהות RBC, WBC, טסיות טסיות וטסיות מופעלות, בהתאמה. מוסיפים את תערובת האב לצינורות להכתמת התאים. אין להוסיף טרומבין.
3. בצינור אחר, הוסף 1 עד 2 מיליון טסיות מטוהרות בעד 100 μL של חיץ צביעה, ופפטיד GPRP 0.4 mM. הוסף טרומבין כדי להפעיל את טסיות הדם ולהכתים את התאים לאחר שלב 2.2.
   הערה: GPRP יש להוסיף לדגימה לפני הוספת טרומבין כדי למנוע צבירה או היווצרות קריש באמצעות הפעלת טסיות. ריכוז תרומבין צריך להיות אופטימלי כדי להשיג הפעלה טובה של טסיות. לאחר הפעלת טסיות הדם, ספירת האירועים יורדת במהלך רכישת דגימות על ידי ציטומטריית זרימה.
4. כבקרה חיובית, הוסף 1 μL של דם שלם בחיץ צביעה של עד 100 μL בצינור ופפטיד GPRP 0.4 mM. מוסיפים טרומבין להפעלת טסיות הדם. כבקרה שלילית, הוסף 1 μL של דם שלם עד 100 μL של חיץ צביעה. אין להוסיף טרומבין לדגימת הבקרה השלילית. צביעת התאים לאחר שלב 2.2.
5. לבקרת איזוטיפ של ציטומטריית זרימה, יש לסמן 5 צינורות עם PE-Cy7, PE, FITC ו-APC לא מוכתמים. הוסף 100 μL של חיץ צביעה, 1 μL של דם, ו 1 μL של נוגדן בהתאמה לצינורות המסומנים כדי להכתים את התאים.
6. דגרו על דגימות כדי להכתים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
7. שטפו את הדגימות על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ צביעה לכל צינור. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך את חיץ הכתמים בזהירות מבלי להוציא את הכדורית.
8. הוסיפו 300 μL של חיץ צביעה לכל צינור, ערבבו בעדינות והעבירו לצינור FACS. אחסנו את הדגימות המוכתמות בחושך עד לניתוח באמצעות ציטומטר זרימה.

תוצאות

איור 1. דם עכבר לפני ואחרי צנטריפוגה עם מדיום שיפוע Iohexol. (A) איוקסול ודם יוצרים שתי שכבות נפרדות לפני הצנטריפוגה אם מוסיפים את דגימת הדם בזהירות. החלונית השמאלית מציגה דיאגרמה סכמטית והחלונית הימנית מציגה את התמונה בפועל. (B) ארבע שכבות נפרדות נראות לאחר צנטריפוגה של דם שלם עם מדיום הדרגתי. החלונית השמאלית מציגה דיאגרמה סכמטית של השכבות והחלונית הימנית מציגה את התמונה בפועל.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חולדה APC נגד עכבר / אדם CD62P (P-selectin)	תרמוסיינטי	17-0626-82	סמן הפעלת טסיות
צינור אפנדורף	פישר סיינטיפיק	14-222-166	צינור לצנטריפוגה
סרום בקר עוברי (FBS)	Invitrogen	26140079	מרכיב לחיץ הכתמה
עכברוש FITC נגד עכבר CD41	BD Biosciences	553848	סמן טסיות
Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)	EMD Millipore	03-34-0001	מניעת היווצרות קריש טסיות
טיפים Pipet 1000 μL, רחב משעמם	תרמופישר סיינטיפיק	21-236-2ג	העברת דגימות דם וטסיות
עכברוש PE נגד עכבר CD45	BD Biosciences	561087	סמן WBC
PE-Cy7 עכברוש נגד עכבר TER 119	BD Biosciences	557853	סמן RBC
טיפים Pipet 200 μL, רחב משעמם	תרמופישר סיינטיפיק	21-236-1א	העברת דגימות דם וטסיות
מלח חוצץ פוספט (PBS)	תרמופישר סיינטיפיק	14040-117	חיץ לשטיפה ודילול
חיץ צביעה	בתוך הבית	פריט שאינו קטלוגי	חיץ שטיפה ודילול
טרומבין	מחקר אנזימים Laboratoty	HT 1002a	אגוניסט להפעלת טסיות
נתרן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	S7653	תמיסת מלח פיזיולוגית
צנטריפוגה עליונה שולחנית	תרמופישר סיינטיפיק	75253839/433607	צנטריפוגת רוטור דלי מתנדנדת
טריצין	סיגמא-אולדריץ'	T0377	Buffer for Nycodenz medium
שפופרת FACS	פישר סיינטיפיק	352008	צינורות לציטומטריית זרימה

דם דם דם דם