בידוד תאי סרטולי בקרה חיסונית מצינוריות זרע עכבר

תקציר

מקור: Bhushan, S. et al., בידוד תאי סרטולי ותאים פריטובולריים מאשכי חולדה.J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים את הליך הבידוד של תאי סרטולי מצינוריות זרע של עכברים, מרכיב באשכים. עיכול אנזימטי ושטיפות חוזרות ונשנות מקדמים את שחרורם של תאי סרטולי לתמיסה, אשר ניתן לגדל בתרבית נוספת לצורך התרבות וצמיחה.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת חומרי מדיה, תמיסות אנזימים ובעלי חיים

1. הכינו 1% יוד אלכוהול על ידי המסת 1 גרם יוד באתנול 100 מ"ל.
2. הכינו 2x 500 מ"ל של Dulbecco פוספט buffered מלוחים (PBS) ללא Ca²⁺ ו Mg²⁺ בתוספת כל אחד עם 7.5 מ"ל D-גלוקוז (100 גרם / ליטר) ו 5 מ"ל 100x פניצילין/סטרפטומיצין תמיסת מלאי (15 מ"ג / מ"ל D-גלוקוז, 50 U/ml פניצילין ו 50 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין סופי).
3. תוסף 1x 500 מ"ל Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 בינוני עם 5 מ"ל 100x פניצילין/תמיסת סטרפטומיצין (50 U/ml פניצילין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין סופי).
4. הכינו תמיסת טריפסין-DNase I (2.5 מ"ג/מ"ל טריפסין ו-10 מיקרוגרם/מ"ל DNase I) על ידי הוספת 25 מ"ג טריפסין ו-0.1 מ"ל DNase I (1 מ"ג/מ"ל DNase I) ל-9.9 מ"ל PBS.
5. ממיסים מעכב טריפסין 50 מ"ג ב-5 מ"ל PBS לתמיסת מעכב טריפסין A (10 מ"ג/מ"ל). ממיסים 25 מ"ג מעכב טריפסין ב-10 מ"ל PBS לתמיסת מעכב טריפסין B (2.5 מ"ג/מ"ל).
6. לתמיסת Collagenase-Hyaluronidase-Deoxyribonuclease I (DNase I) יש להמיס 10 מ"ג Collagenase A (1 מ"ג/מ"ל סופי), 10 מ"ג היאלורונידאז (1 מ"ג/מ"ל סופי) ו-0.1 מ"ל DNase I (1 מ"ג/מ"ל DNase I) (10 מיקרוגרם/מ"ל סופי) ב-10 מ"ל PBS.
7. הכינו תמיסת היאלורונידאז-DNase I על ידי הוספת 10 מ"ג היאלורונידאז (1 מ"ג/מ"ל סופי) ותמיסת DNase I 0.1 מ"ל (1 מ"ג/מ"ל) (10 מיקרוגרם/מ"ל סופי) ל-9.9 מ"ל PBS.
8. הזמינו חולדות Wistar בזמן כך שהן יהיו בנות 19 יום ביום בידוד תאי סרטולי.
   הערה: הפרוטוקול המתואר מיועד ל-10 חולדות, אך ניתן לשנותו עבור מינימום של 5 ומקסימום של 20 חולדות. יש להתאים את הנפחים של כל הפתרונות בהתאם.
   בפרוטוקול הבא "פיפטה" מייצג פיפטה סרולוגית.

2. הכנת צינוריות זרע

1. הרדימו 10 חולדות וויסטאר זכרים בזו אחר זו במייבש באמצעות_CO2 וקצב זרימה שמחליף לפחות 20% מנפח התא לדקה. חכו עד שהנשימה תיפסק, בדקו את ההרדמה על ידי לחיצה על כרית כף הרגל, ואם אין תגובה הרדימו כל חולדה על ידי נקע צוואר הרחם. יש לנקז את הדם על ידי חיתוך וריד הצוואר ועורק התרדמה (נרתיק קרוטיקה - vagina carotica) מתחת למים זורמים. לחטא את הבטן על ידי ניגוב עם 70% אתנול.
2. בעזרת מלקחיים הרימו את העור משרירי הבטן וחתכו אונת עור בצורת אליפסה שנמתחת מסימפיזיס הערווה ועד עצם החזה (איור 1A) והניפו אותה כלפי מעלה אל החזה. לאחר מכן, לתפוס את שרירי הבטן ולעשות חתך מדיאלי מן סימפיזת הערווה אל עצם החזה.
   1. סחטו את הבטן עם האגודלים מהאגן כלפי מעלה על מנת לדחוף את האשכים החוצה מהאגן התחתון. בחרו את כרית השומן האפידידימלית (איור 1B) עם מלקחיים כדי למשוך את האשכים הלאה. חתכו את חוט הזרע (איור 1B), השאירו את הטוניקה אלבוגיניאה שלמה, ואספו את כל האשכים ב-PBS של 20 מ"ל בצינור חרוטי של 50 מ"ל (איור 1C).
3. לאחר איסוף כל האשכים, לחטא אותם על ידי הוספת נפח שווה (20 מ"ל) של 1% (w / v) יוד אתנול. הופכים את הצינור פעמיים ומרוקנים את הסופרנאטנט מיד. שטפו במהירות את האשכים פעמיים עם PBS של 25 מ"ל כל אחד (איור 1D).
4. העבירו את האשכים לצלוחית פטרי המכילה PBS בנפח 15 מ"ל (איור 1E). אוחזים כל אשך בחוזקה על ידי מלקחיים בקצה אחד, מבצעים חתך קטן לתוך הטוניקה אלבוגיניאה בקצה הנגדי, וסוחטים את הצינוריות באמצעות להבי מספריים סגורים ככלי גירוד.
   הערה: הצינוריות עדיין צריכות ליצור צרור קומפקטי בצורת אשך עם רק כמה צינוריות הנמשכות לתוך התמיסה כדי לאפשר עיכול אנזימטי הומוגני (איור 1F).
5. מעבירים את האשכים נטולי הקפסולה לבקבוק פקק בורג 100 מ"ל המכיל 10 מ"ל תמיסת טריפסין-DNase I. בצע את העיכול באמבט מים רועד ב 32 ° C (120 תנודות / דקה). לאחר 4 דקות להעריך את הצינוריות בעין בלתי לפיזור צינוריות. ברגע שהצינוריות מתחילות להתפזר לתוך התמיסה, להפסיק את העיכול מיד. במידת הצורך, ממשיכים לדגור עד 2 דקות.
6. עצור את עיכול טריפסין על ידי הוספת 5 מ"ל של תמיסת מעכבי טריפסין A. ערבבו היטב את התמיסה על ידי פיפטציה למעלה ולמטה 3-4 פעמים באמצעות פיפטה של 10 מ"ל והעבירו אותה לצינור חרוטי של 50 מ"ל.
7. לאחר 5 דקות של דגירה התבוננו בצינוריות השוקעות על ידי יחידת הכבידה, הסירו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של 10 מ"ל משלב 2.6, והוסיפו 10 מ"ל של תמיסת מעכב טריפסין B על מנת לעצור לחלוטין את עיכול הטריפסין. להשהות מחדש את הצינוריות על ידי pipeting למעלה ולמטה 2-3 פעמים.
8. על מנת להסיר תאים interstitial מזהמים, לשטוף את הצינוריות 9 פעמים עם 25 מ"ל PBS כל אחד. השהה מחדש את הצינוריות בכל שטיפה באמצעות פיפטה של 25 מ"ל ואפשר להן לשקוע על ידי יחידת הכבידה למשך 10 דקות. השתמש תמיד באותה פיפטה של 25 מ"ל עבור pipetting PBS, השעיה, והסרת supernatant.

3. הסרה/בידוד של תאים פריטובולריים (PTCs)

1. העבירו את כל הצינוריות לבקבוק פקק בורג של 100 מ"ל והוסיפו את תמיסת Collagenase-Hyaluronidase-DNase I (איור 2A). יש לבצע עיכול במשך 10 דקות באמבט מים מטלטל בטמפרטורה של 32°C (120 תנודות לדקה).
2. טפחו טיפה של המתלה על מגלשת זכוכית ובדקו במהירות את הצינוריות תחת מיקרוסקופ אור הפוך לתרבית תאים שגרתית בהגדלה של פי 100. אם העיכול אינו מתקדם מספיק, יש להמשיך את הדגירה למשך 2 דקות נוספות (אין לספור את הזמן הדרוש לבדיקה המיקרוסקופית).
   הערה: במהלך השלב הזה כל הצינוריות מתקצרות באורכן, וקצוות הצינוריות צריכים להיות מחוספסים (איור 2B ו-C). קצוות מחוספסים מעידים על שחרור תאים פריטובולריים.
3. מעבירים את התרחיף עם צינוריות מעוכלות לצינור חרוטי של 50 מ"ל באמצעות פיפטה של 25 מ"ל משלב 2.8. לשטוף את בקבוק 100 מ"ל עם 10 מ"ל PBS ולהוסיף אותו צינוריות בצינור חרוט. הניחו לצינוריות המעוכלות להתיישב על ידי יחידת הכבידה למשך 10 דקות, ושאפו בזהירות את הסופרנאטנט, המכיל את ה-PTCs, באמצעות פיפטה של 25 מ"ל שוב, והעבירו אותו לצינור חרוטי חדש. עבור שאיפה של מיליליטרים האחרונים להשתמש פיפטה 5 מ"ל על מנת למנוע כל נשיאה של צינוריות.

4. בידוד תאי סרטולי (SCs)

1. השהה מחדש את הצינוריות המשוקעות משלב 3.3 ביסודיות ב- 25 מ"ל של PBS באמצעות פיפטה של 25 מ"ל ואפשר להן לשקוע על ידי יחידת הכבידה למשך 12 דקות. השתמש באותה פיפטה של 25 מ"ל עבור PBS pipetting, השעיה של צינוריות, והסרת supernatants. חזרו על הכביסה 3 פעמים (4 כביסות בסך הכל).
2. לאחר השטיפה האחרונה מעבירים את הצינוריות המעוכלות לבקבוק נוסף בעל פקק בורג של 100 מ"ל המכיל את תמיסת Hyaluronidase-DNase I. בצע את העיכול באמבט מים רועד ב 32 ° C (120 תנודות / דקה).
3. לאחר 5 דקות בדוק שוב את הצינוריות על ידי בדיקה מיקרוסקופית קלה בהגדלה של 100X כמתואר בשלב 3.2.
   הערה: צינוריות קצרות, אגרגטים צינוריים ותאים משוחררים צריכים להיות גלויים לעין (איור 2D).
   1. הניחו לצברים הצינוריים להסתפק במשך 10 דקות, ושאפו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של 25 מ"ל. שטיפה מצטברת 4 פעמים באמצעות PBS של 25 מ"ל וזמן שיקוע של 10 דקות עבור כל שלב כביסה (איור 2E).
4. מוסיפים 20 מ"ל של סל"ד 1640 בינוני ומעבירים את המתלה 10 פעמים דרך מחט 18 גרם המורכבת על מזרק 20 מ"ל. הימנעו מבועות אוויר.
   הערה: משיכת המתלה פנימה והחוצה דרך המחט נחשבת כמעבר אחד. הפרעה והומוגניזציה של תאים על ידי גזירה הידרודינמית היא טכניקה סטנדרטית בהכנת תאים הנוטים להצטבר. המעבר של תאים דרך מחט היפודרמית בקוטר פנימי קטן לא צפוי להשפיע על התכונות התפקודיות שלהם. איור 3C ו-D מראים את מבנה העל הרגיל של תאי סרטולי מטוהרים ביום ה-4 של התרבית.
   1. טפחו טיפה של המתלה על מגלשת זכוכית ובדקו במהירות את הצינוריות תחת מיקרוסקופ אור הפוך לתרבית תאים שגרתית בהגדלה של פי 10 אם כל הצברים מפוזרים (איור 2F). סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר על מנת לקבל תרחיף חד תאי טהור בתסנין.
5. צנטריפוגה את התסנין של שלב 4.4 ב 200 x גרם במשך 10 דקות ב RT מבלי להשתמש בהפסקה. בזהירות לשאוף את supernatant באמצעות פיפטה 25 מ"ל, ולהשהות מחדש את תאי Sertoli ב 40 מ"ל RPMI 1640 בינוני (ללא סרום).
6. יש לערבב תרחיף תאים של 100 μl עם 100 μl של Trypan Blue Stain ולספור תאים עם תא Neubauer Enhanced chamber. התאם את ריכוז התא ל 3 x 10⁶ תאים / מ"ל בהתאם לתוצאת הספירה. זרע 1 מ"ל לכל באר על צלחת 6 בארות (= יום 1). הערה: תאי סרטולי בתרחיף מתיישבים במהירות ולכן יש לנער את הצינור בקצרה בכל פעם לפני שלוקחים אליקוט של התא עם הפיפטה. עד היום הרביעי הם נצמדים בחוזקה לתת-הרובד.

תוצאות

איור 1. אשכים מחולדות וויסטאר נכרתו ונערפו.(A) חלל הצפק נפתח דרך חתך אורכי כמתואר בטקסט. כוכבית (*) מציינת את כרית השומן האפידימלי. (B) האשכים מוסרים על ידי חיתוך חוט הזרע ו-(C) נאספים בצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל PBS של 20 מ"ל. כאשר כל האשכים נאספו הם מחוטאים ב 20 מ"ל של 1% (w / v) יוד אתנול. להסרת היוד, הם נשטפים במהירות פעמיים עם 25 מ"ל PBS כל אחד. (D) אשכים לאחר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מסננות תאי קורנינג™ 70 מיקרומטר	קורנינג	431751	צבע לבן
DAPI mountant ProLong® זהב Antifade	לייף טכנולוגיות	P-36931
D-גלוקוז	סיגמא	G8644	100 גרם/ליטר
PBS של Dulbecco ללא Ca2+/Mg2+	גיבקו	14190-094
DNase I	רוש	10104159001
היאלורונידאז מאשך בקר	סיגמא	H3506
פניצילין (5,000 U/ml) סטרפטומיצין (5,000 מיקרוגרם/מ"ל)	גיבקו	15070-063	פתרון 100x
RPMI-1640	גיבקו	21875-034	מכיל 300 מ"ג/ליטר L-גלוטמין
טריפסין מלבלב חזירי	סיגמא	T5266
טריפאן כתם כחול (0.4%)	גיבקו	15250-061
מעכב טריפסין מפולי סויה	סיגמא	T6522	המוצר Sigma זול משמעותית מאשר BPTI בשימוש בעבר (Aprotinin) של Roche.
חולדות וויסטאר WU	Charles נהר	לא ישים	צריך להיות בן 19 יום ביום הניסוי.