בידוד סלקטיבי של תאי T CD4+ Vδ1+ γδ מתאי דם מונוגרעיניים היקפיים אנושיים

תקציר

מקור: Welker, C., et al. בידוד ו- ex vivo תרבות של תאי T Vδ1⁺CD4⁺γδ, אב תאי αβT אקסטרתימי. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מדגים פרוטוקול לבידוד מבוסס תיוג מגנטי של אוכלוסייה בריכוז נמוך של תאי T CD4⁺Vδ1⁺γδ מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs). באמצעות שילוב של נוגדנים מצומדים נגד Vδ1 FITC, מיקרו-חרוזים מגנטיים נגד FITC וחרוזים על-פאראמגנטיים מצופים נוגדנים נגד CD4, תאי T CD4⁺Vδ1⁺ יכולים להיות מטוהרים בהצלחה מאוכלוסיית PBMC.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. בידוד תאי T Vδ1

1. קח <1 x 10⁶ לימפוציטים מבודדים עבור FACS ראשוני קביעת התדירות של Vδ1 CD4 T cells.
   הערה: גודל האוכלוסייה של ישות תאי T זו עשוי להיות שונה מאוד בין פרטים ובהתאם למצבם החיסוני. בדרך כלל, כ-1% מתאי T הם Vδ1⁺ וכ-1-5% מתאי Vδ1⁺ הם CD4⁺.
   1. לדלל את התאים עם 1 מ"ל מאגר FACS, אשר מורכב PBS המכיל 2% FCS ו 5 mM EDTA. צנטריפוגה ב 660 x גרם במשך 2 דקות ו decant supernatant. נפח הריפלוקס של כ -100 μl חיץ FACS מספיק עבור הצביעה הבאה. מערבול קצר ודגור על התאים עם מגיב חוסם Fc 5 μl למשך 5 דקות ב- RT לספציפיות מוגברת של צביעת FACS.
   2. הוסף נוגדנים חד-שבטיים אנושיים ישירות לתאים מבלי להסיר את מגיב חסימת Fc. הקפידו להכתים את התאים בנוגדנים נגד Vδ1 (1:50), CD3 (1:50), CD4 (1:200), CD8 (1:200) ו-TCRαβ (1:25). הכן את בקרת האיזוטיפ עם איזוטיפים אימונוגלובולינים המתאימים. לדגור על תאים עם נוגדנים במשך 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
   3. שטפו את התאים במאגר FACS של 1 מ"ל (צנטריפוגה למשך 2 דקות; ב 660 x גרם), נטרלו את הסופרנאטנט, והמשיכו לרכישת FACS בנפח המאגר הנותר.
2. גלולה את התאים (שאינם משמשים בניתוח FACS) על ידי צנטריפוגה במשך 12 דקות; ב 300 גרם; 8 °C. להסיר את supernatant ולהשהות מחדש את גלולת התא ב 60 μl MACS-buffer לכל 1 x 10⁷ תאים. הוסף מגיב חוסם Fc של 20 μl לכל 1 x 10⁷ תאים ודגור במשך 5 דקות ב-4°C.
3. הוסף 10 μl FITC-מצומד נוגדן Vδ1 אנטי אנושי לכל 1 x 10⁷ תאים ישירות לתאים. יש לדגור במשך 12 דקות ב-4°C (4°F) בחושך.
4. שטפו את התאים באמצעות מאגר MACS של 14 מ"ל (צנטריפוגה למשך 12 דקות; ב-300 גרם; 8°C). השליכו את הסופרנאטנט לחלוטין והשהו מחדש את התאים במאגר MACS של 80 μl לכל 1x10⁷ תאים.
5. קח 1-2 x 10⁵ תאים ודלל אותם במאגר FACS של 100 μl לאימות התיוג על ידי ניתוח FACS. אין צורך בתוספים נוספים לשלב זה. ודא שיש הבדל מספיק בבהירות עבור תאים Vδ1^- ו- Vδ1⁺. אם זה לא המקרה, חזור על שלבים 1.3 ו- 1.4.
6. הוסף 20 μl anti-FITC microbeads לכל 1 x 10⁷ תאים לתאים הנותרים, לערבב היטב, לדגור במשך 15 דקות בחושך ב 4 ° C. לאחר מכן, שטפו את התאים באמצעות מאגר MACS של 10 מ"ל לפחות (צנטריפוגה למשך 12 דקות, בטמפרטורה של 300 x גרם; 8°C).
7. במהלך הצנטריפוגה, אזנו את העמוד המגנטי המקורר מראש שהונח במגנט עם מאגר MACS של 500 μl.
8. השהה מחדש את התאים במאגר MACS של 500 μl (עבור מספרי תאים גבוהים מ- 1 x 10⁸, הרחב נפח זה בהתאם) והחל את התאים בזהירות על העמודה. אסוף את הזרימה המכילה את תאי Vδ1^.
9. שטפו את העמוד שלוש פעמים עם מאגר MACS של 500 μl ואספו את הזרימה שוב באותו צינור. שים לב שהמאגר חייב להיות ריק לפני החלת חיץ על העמוד.
10. הסר את העמוד מהמכשיר המגנטי והכנס אותו לצינור חרוטי של 15 מ"ל. שטוף במהירות את העמוד עם מאגר MACS של 1 מ"ל על-ידי דחיפת הבוכנה בחוזקה לתוך העמודה. לאסוף את eluate ב tube.
    הערה: על מנת לקבל טוהר של >98%, בדרך כלל יש צורך לחזור על שלבים 1.7-1.9 עם עמודה שנייה.
11. אמת את טוהר התאים על ידי ניתוח FACS עם אותו לוח נוגדנים כמו קודם (ראה 1.1.2) וספור את התאים.

2. בידוד תאי T Vδ1CD4⁺

1. השהה מחדש 25 μl של חרוזי CD4 עם מערבולת למשך >30 שניות. שטוף את החרוזים (הכמות המינימלית כפי שמתואר על ידי היצרן) במאגר MACS של 1 מ"ל בצינור תגובה של 1.5 מ"ל על ידי הכנסת הצינור למגנט למשך דקה אחת. השליכו את הסופרנאטנט בזהירות עם פיפטה בקנה מידה קטן (200 מיקרוליטר) והשהו מחדש את החרוזים בנפח המקורי של מאגר MACS.
2. הפילו תאי Vδ1⁺ (צנטריפוגה למשך 12 דקות; ב-300 x גרם) ושאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כל תאי Vδ1⁺ במאגר MACS של 500 μl והוסיפו אותם לצינור המכיל את החרוזים. מערבבים במרץ ודגרים במשך 20 דקות ב-4°C עם הטיה קבועה (למשל במסובב
).
3. מניחים את הצינור המכיל את התאים במגנט למשך 2 דקות. ודא שאין שרידים במכסה.
   הערה: תאי ^CD4+ יקשרו את החרוזים המגנטיים ויתחברו לצד הצינור הפונה למגנט.
4. פתח בזהירות את המכסה תוך שמירה על הצינור בתוך המכשיר המגנטי ואסוף את הסופרנאטנט המכיל את תאי CD4-Vδ1⁺ באמצעות פיפטה בקנה מידה קטן. מקם תאי CD4-Vδ1⁺ בצינור נפרד ומקם צינור זה שוב במגנט כדי למנוע תאי CD4 או חרוזים שנותרו מהאוכלוסייה.
   1. שטפו את תאי CD4 במאגר MACS של 5 מ"ל (צנטריפוגה למשך 12 דקות; ב 300 x גרם) והשהו אותם מחדש בריכוז של 1 x 10⁵ תאים לכל מדיה של 100 מיקרוליטר. CD4^- תאים ניתן לטפח בקלות בתנאים מתאימים.
5. מקם את הצינור עם מטרות התא CD4⁺ מחוץ לשדה המגנטי, להשהות מחדש את התאים במאגר MACS 500 μl, ולהחזיר אותם לתוך המכשיר המגנטי. חזור על שלבים 2.3-2.5 פעמיים כדי לקבל טוהר גבוה יותר. הסר supernatant על ידי pipetting.
6. השהה מחדש את תאי CD4⁺ במדיה תרבית של 100 μl (RPMI 1640, 10% FCS, 1% L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין) והוסף 10 μl של תמיסת ניתוק חרוזים. יש לדגור ב-RT במשך 45 דקות עם הטיה קבועה (למשל, במסובב).
7. הניחו את התאים במגנט למשך דקה אחת. אספו בזהירות את הסופרנאטנט המכיל תאי Vδ1⁺CD4⁺ נטולי חרוזים באמצעות פיפטה בקנה מידה קטן.
8. מחוץ למגנט, השהה מחדש את החרוזים עם מדיה תרבית של 100 μl וחזור על שלבים 2.6 ו -2.7 פעמיים כדי לקבל מספרי תאים גבוהים יותר של תאי CD4⁺.
9. מטילים את התאים (צנטריפוגה בגודל 300XG, למשך 12 דקות) ומשליכים את הסופרנאטנט לחלוטין על ידי פיפטציה. יש להשהות מחדש תאים במדיה טרייה שחוממה מראש ולספור אותם. בחן את טוהר תאי Vδ1⁺CD4⁺ על ידי ניתוח FACS המתואר בשלבים 1.1.1-1.1.3.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מלח חוצץ פוספט	סיגמא אולדריץ'	D8537
מאגר MACS	Miltenyi ביוטק	130-091-222	יש ליטול תוסף עם BSA ולהתקרר מראש לפני השימוש
BSA	Miltenyi ביוטק	130-091-376	לא חובה מספק זה
Vd1 FITC אנטי-אנושי (שיבוט: TS8.2)	תרמו סיינטיפיק	TCR2730	לא חובה מספק זה
CD3 PerCP אנטי-אנושי (שיבוט: SK7)	BD BioSciences	345766	לא חובה מספק זה או פלואורוכרום זה
TCRab PE אנטי-אנושי (שיבוט: T10B9.1A-31)	BD BioSciences	555548	לא חובה מספק זה או פלואורוכרום זה
CD4 VioBlue אנטי-אנושי (שיבוט: MT466)	Miltenyi ביוטק	130-097-333	לא חובה מספק זה או פלואורוכרום זה
CD8 APC-H7 אנטי-אנושי (שיבוט: SK1)	BD BioSciences	641400	לא חובה מספק זה או פלואורוכרום זה
ערכת MultiSort נגד FITC	Miltenyi ביוטק	130-058-701	מניב תוצאות טובות יותר מאשר Anti-FITC MicroBeads
עמודות MS	Miltenyi ביוטק	130-042-201	מצננים מראש לפני השימוש
מפריד MiniMACS	Miltenyi ביוטק	130-042-102
ערכת בידוד חיובית CD4	טכנולוגיות חיים	11331ד