טכניקת מבחנה ליצירת מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות אנושיות

תקציר

מקור: Najmeh, S., et al. בידוד וטיפול במלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות אנושיות פשוטות (NETs). J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה ליצירת ובידוד מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs). נויטרופילים מבודדים מדם היקפי ומעוררים באמצעות phorbol myristate acetate (PMA) כדי לייצר NETs. במהלך הדגירה, הנויטרופילים עוברים תהליך של מוות תאי (NETosis) כדי לשחרר NETs המורכבים מכרומטין מעובה מעורבב עם חלבונים ציטופלזמיים גרגיריים.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. יצירת רשתות

1. לעורר נויטרופילים עם 500 ננומטר של PMA (לכל 30 מ"ל של תמיסת נויטרופילים) ולדגור על צלחת תרבית רקמה שטוחה 150 x 25 מ"מ עם רשת 20 מ"מ במשך 4 שעות ב 37 ° C 5% CO₂. זה יאפשר NETosis.
2. לאחר 4 שעות של גירוי, בעדינות לשאוף ולהשליך את התקשורת, משאיר את שכבת NETs ונויטרופילים דבק בתחתית. אין לשבש שכבה זו.
3. באמצעות סך של 15 מ"ל של PBS קר ללא Ca ו Mg לכל מנה, לשטוף את החלק התחתון של כל צלחת על ידי pipeting 15 מ"ל של PBS על החלק התחתון של הכלי על מנת להרים את כל החומר דבק מלמטה.
4. אספו תמיסה המתקבלת משטיפת כל צלחת (שלב 1.3) בצינור חרוטי של 15 מ"ל וצנטריפוגה למשך 10 דקות ב 450 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס. נויטרופילים וכל התאים הנותרים יכדורו בתחתית, וישאירו סופרנטנט עשיר ב- NET נטול תאים.
5. מחלקים את הסופרנאטנט לצינורות מיקרו-צנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל ומסתובבים במשך 10 דקות בטמפרטורה של 18,000 x גרם ב-4°C. זה יאפשר לכל הדנ"א להתגלול.
   הערה: צנטריפוגה בצינורות גדולים יותר היא קלה יותר וגוזלת פחות זמן אם ניתן להשיג מהירויות כה גבוהות בצנטריפוגה הרגילה, אחרת יהיה צורך לחלק סופרנאטנטים בצינורות קטנים יותר כדי להשתמש במיקרו-צנטריפוגות במהירות גבוהה.
6. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את כל הכדוריות המתקבלות יחד ב-PBS קר כקרח לריכוז המתאים ל-2 x 10⁷ נויטרופילים לכל 100 מיקרוליטר PBS. זה יניב את מלאי NET ללא תאים שניתן להשתמש בו לניסויים הבאים.
7. למדוד את ריכוז ה- DNA בדגימה המתקבלת באמצעות ספקטרופוטומטריה או כלי כימות DNA חלופי. ריכוז נאות במדגם צריך לנוע בין 140 - 180 ng / μl.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מלח חוצץ פוספט (PBS) של Dulbecco, מעובד, ללא סידן כלורי ומגנזיום כלורי	וויסנט	311-425-CL
RPMI-1640 בינוני עם L-גלוטמין	וויסנט	350-000-CL	תמיסת 3% RPMI מיוצרת על ידי תוספת RPMI עם סרום בקר עוברי 3%
פורבול 12-מיריסטט 13-אצטט (PMA)	סיגמא-אלדריך	P8139
סרום בקר עוברי (FBS)	וויסנט	080-150
צלחת תרבית רקמות אינטגרידית עם רשת 20 מ"מ (150 x 25 מ"מ)	בז	353025