בידוד רשת תאי מערכת החיסון של חניכיים מחסימות שיניים מורין

תקציר

מקור: Dutzan, N. et al., בידוד, אפיון ובדיקה תפקודית של רשת תאי החיסון של החניכיים. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את הליך הבידוד של רשת תאי החיסון של חניכיים ממודל עכבר. העיכול האנזימטי משחרר את רקמת החניכיים מהשיניים והעצם המצורפות, אשר מתעכלת באופן מכני נוסף, ומשחרר תאים חיסוניים מהחניכיים. התאים המבודדים מוכנים לניסויים אימונולוגיים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. התכוננו מראש

1. הכנת מדיה מלאה: RPMI בתוספת 2 mM L-גלוטמין, 100 יחידות / מ"ל פניצילין, 100 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין, ו 10% FBS.
2. הכנת מדיית DNase: 50 מ"ל של חומרי RPMI בתוספת 7.5 מיקרוגרם DNase (לעשות טרי, לשמור על קרח בכל עת).
3. הכינו מדיית Collagenase-DNase: 5 מ"ל של חומר DNase בתוספת 3.2 מ"ג/מ"ל של Collagenase Type IV (הכנה טרייה, שמירה על קרח בכל עת).
4. צנטריפוגה מראש קירור ל 4 ° C.
5. אינקובטור שייקר חם ל 37 °C (77 °F).

2. בידוד, דיסקציה ובידוד תאים מגושי חניכיים

1. הרדימו עכברים על ידי חשיפתם ל-CO2 בתא מתאים, בהתאם להנחיות הוועדה המייעצת למחקר בבעלי חיים (ARAC).
2. פתח את חלל החזה והבטן כדי לחשוף את הלב ואת האיברים הפנימיים. כדי לנקב, יש לבצע חתך בווריד הנבוב התחתון ולנקב 3 מ"ל של PBS דרך החדר השמאלי באמצעות מזרק 3 מ"ל עם מחט 27 גרם.
3. לשתק את הגוף ואת הראש של העכבר על כרית עם הבטן פונה כלפי מעלה.
4. חותכים כל קומיסורה של השפה לכיוון הצוואר עם מספריים, מפרידים את העור המכסה את אזור הלסת והצוואר, וחושפים את הרקמות והשרירים שמתחתיו. נתחו את השפה התחתונה כדי לחשוף את הלסת התחתונה.
5. חותכים בין החותכות התחתונות כדי להפריד בין שני צידי הלסת התחתונה ולשתק כל צד כדי לגשת לחלל הפה.
6. דמיינו ונתחו את החיך הרחק מחלל האף.
7. נתחו אזורים באמצעות 10 להבים וכללו אזורים טוחנים מקסילריים ומנדיבולריים עם חניכיים מסביב (איור 1). בצעו חתכים אנכיים רק קדמיים לטוחנת הראשונה ואחוריים לטוחנת השלישית וחתך אופקי בגבול החניכיים (צווארון לבן של רקמה סביב השיניים).
8. מניחים את הבלוקים המקסילריים והמנדיבולרים בצינור חרוטי של 50 מ"ל עם 5 מ"ל Collagenase/DNase (שומרים על קרח).
9. יש לדגור באינקובטור שייקר בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת ובמהלך 5 הדקות האחרונות של הדגירה להוסיף 50 μl של 0.5 M EDTA.
10. הוסף 5 מ"ל של חומר DNase קר לצינור 50 מ"ל עם רקמות ומערבל בעדינות כדי לערבב.
11. מעבירים את 4 גושי הרקמה לצלחת פטרי ומכסים אותם ב-500 מיקרוליטר של מדיה DNase. הסר חניכיים מכל גוש רקמה, באמצעות להב אזמל וכיוון את הלהב לאזור החניכיים והבין-שיניים.
12. העבר את הרקמות ואת המדיה מצלחת הפטרי, כמו גם את מדיית ה- DNase הקודמת ששימשה במהלך הדיסקציה לצינור חדש של 50 מ"ל דרך מסננת התא (בגודל 70 מיקרומטר). יש לשטוף במדיית DNase (3-5 מ"ל) את כל המכשירים בהם נעשה שימוש ולסנן.
13. באמצעות הבוכנה של מזרק סטרילי 3 מ"ל, לרסק את הרקמה נגד מסננת, סינון עם מדיה DNase קר (30 עד 35 מ"ל).
14. שטפו את מסננת התאים במדיית DNase קרה.
15. צנטריפוגה ב-4°C, 314 x גרם למשך 6 דקות.
16. השליכו את הסופרנטנט והשעו אותו מחדש ב-1 מ"ל של מדיה מלאה.
17. ספירת תאים (הכמות הצפויה צריכה לנוע בין 8 x 10⁵ ל- 1.2 x 10⁶ תאים עם כדאיות של >80%) באמצעות מונה תאים אוטומטי.

תוצאות

איור 1: בידוד של חניכיים מוריניות. איור המדגים את גבולות הדיסקציה במקסילה ובמקטע החניכיים המבודד שישמש לדיסקציה של רקמת חניכיים. (B) קטע של מקסילה מורין (אזור מולרי) עם מתאר לדיסקציה של בלוקים, ובלוק מבודד. כתם המטוקסילין ואוסין (H&E) של מקטע מולארי מקסילרי עם רקמות חניכיים מתוארות מוצג בהגדלה נמוכה (C) ומעלה ב-(D). צוינו הגדלות מקוריות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מספריים עדינים	כלים מדעיים משובחים	14058-11
ידית אזמל #3	כלים מדעיים משובחים	10003-12
להבי אזמל #10	כלים מדעיים משובחים	10010-00	עקר
מלקחיים ספלינטר	אינטגרה מילטקס	6-304
מחטים עם שיפוע רגיל	BD מדיקל	305109	27G, אורך 12.7 מ"מ
מזרקים מונוג'קט	קובידיאן	8881513934	קצה נעילה Luer, 3 מ"ל
PBS, pH 7.4	לייף טכנולוגיות	10010-049	ללא סידן ומגנזיום
RPMI 1640	לונזה	12-167F	ללא L-גלוטמין
DNase I מלבלב בקר	סיגמא-אולדריץ'	DN25-1G
Collagenase סוג IV	Gibco (מבית Life technologies)	17104-019
סרום בקר עוברי	מוצרי Gemini Bio	100-106
גנטמיצין 50 מ"ג/מ"ל	איכות ביולוגית	120-098-661EA
Pen Strep	Gibco (מבית Life technologies)	15140-122
ל-גלוטמין	Gibco (מבית Life technologies)	25030-081
0.5M EDTA pH 8.0	איכות ביולוגית	351-027-721EA
צינורות 50 מ"ל	קורנינג	352070	פוליפרופילן, סטרילי
מסננות תאים 70 מיקרומטר	קורנינג	352350
צלחות פטרי	קורנינג	351029	עקר