$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. דגימות רקמת ריאה
הערה: עבור מחקרי in vivo של רקמת ריאה, יש ללמוד את הדגימות לאחר החשיפה הרלוונטית. החשיפה הרלוונטית ביותר לניסוי זה היא מיקרואורגניזמים זיהומיים, בעיקר חיידקים. זני עכברים שיכולים לשמש לשיטה זו הם עכברי C57BL/6 או BALB/c, בני 10 - 12 שבועות, משקל 25 - 30 גרם, וזכר.
- המתת חסד של עכברים, באמצעות הזרקה תוך צפקית של קטמין (400 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (40 מ"ג/ק"ג). פתח את חלל בית החזה וחשף את הריאות והלב באמצעות מלקחיים כירורגיים ומספריים.
- להחדיר PBS חם באמצעות מחט 21 מד לתוך החדר הימני כדי לשטוף את הדם מן הכלים במשך 30 שניות, ולאחר מכן להחדיר 10 מ"ל של 2% PLP קיבוע במשך 30 s (לתוך החדר הימני).
- השתמש PBS חם (42 ° C) כדי לשטוף את חלל החזה הפתוח. יש לבצע אינטובציה של קנה הנשימה בעזרת מחט בעל 21 מד וחתיכה של צינור בקוטר 0.8 מ"מ החתוך למידה, ולהזריק 800 מיקרוליטר של תמיסת אגרוז מחוממת מראש (ל-42°C), נקודת התכה נמוכה של 3%.
- לקשור את קנה הנשימה עם משי קלוע (4.0 USP). הניחו את החוט סביב קנה הנשימה, ממש מתחת לנקודת ההחדרה של הצינורית, והדקו אותו באמצעות קשר ידני פשוט. כדי לחזק את האגרוז, יש לתת PBS קר כקרח סביב הריאות. הסר את הריאות והלב כבלוק מחלל בית החזה באמצעות מספריים ודיסקציה קהה. הסר כל ריאה בנפרד ולאחר מכן תקן אותם במשך 16 שעות ב 2% PLP או פורמלין ב 4 ° C.
- אחסנו את הדגימות ב-PBS בטמפרטורה של 4°C עד לחיתוך הרקמות.
- כדי להכין את דגימות רקמת הריאה, השתמש בשלבים הבאים.
- יש לקבע רקמות ריאה (שנכרתו בשלב 1.1) ב-10% פורמלין טבעי למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. מעבירים לאתנול 75% ומכניסים למעבד רקמות במחזור של 12 שעות (2.5 שעות ב-75% EtOH, 3 שעות ב-EtOH מוחלט, 3.5 שעות בממס 3B ו-3 שעות בפרפין).
- הטמע בפרפין סטנדרטי כדי ליצור בלוקים קבועים פורמלין, משובצים פרפין (FFPE) המאוחסנים בטמפרטורת החדר.
הערה: בשלב זה, זה בדרך כלל נוח לחתוך את קטעי הריאה עבור שקופיות סטנדרטיות.
- חתכו את קטעי הריאה FFPE בעובי 4 - 5 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום והרכיבו אותם על שקופיות טעונות מצופות.
- כדי להרכיב שקופיות, שים 3 טיפות של אמצעי הרכבה על כיסויים בגודל 60 מ"מ x 24 מ"מ (גודל 1.5), הפוך את השקופית על הכיסוי ודחף החוצה את המדיום העודף. אטמו אותם הרמטית בלק ואחסנו אותם בטמפרטורת החדר.
2. הכנה/מיקרוסקופיה של דגימות רקמת ריאה
- כדי להסיר שעווה, להחזיר לחות ולטפל בדגימת רקמת הריאה FFPE עם תמיסת אחזור אנטיגן.
- ייבשו בתנור את מגלשות ה-FFPE למשך 60 דקות ב-60°C. לאחר מכן הכניסו את המגלשות לתמיסת קסילן למשך 30 דקות והעבירו לתמיסת אתנול 70% למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף במי ברז.
- יש להניח בניילון נצמד חסין חום ובכפוף לשליפת אנטיגן HIER בסיר לחץ למשך 10 דקות ב-10 מ'/מול/ל' טריס, 1 mmol / EDTA pH 9.0. מצננים במשך 20 דקות. שטפו פעמיים במי ברז במשך 5 דקות על נדנדה, ואז פעם אחת עם PBS על נדנדה.
- יש להוסיף 10% סרום עוף ב-5% BSA/PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- מכתימים את הרקמה.
- כדי להגדיר METs במקרופאגים, הוסף נוגדנים ראשוניים (MMP-9, H3Cit ו- F4/80) ב- 1% BSA/PBS למשך 16 שעות ב- 4 ° C בדילול של 1/100 (פרטים ספציפיים על כמויות נוגדנים מפורטים בטבלת החומרים). שטפו פעמיים עם PBS במשך 5 דקות על נדנדה.
- השג זיהוי פלואורסצנטי על ידי דגירה עם נוגדנים משניים מתאימים ב-1% BSA/PBS למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר. נוגדנים הם: (1) עוף נגד עכבר 488 (ירוק), (2) עוף נגד עז 594 (אדום), ו (3) חמור נגד עכבר 647 (אדום רחוק).
- שטפו את המקטעים ב-PBS והרכיבו אותם באמצעי הרכבה המכיל DAPI לצביעת כרומטין.
- קבל תמונות פלואורסצנטיות באמצעות ראש סריקת לייזר קונפוקלי המחובר למיקרוסקופ הפוך.
- לעורר את ההכנה עם לייזרים 405, 488, 561, ו 647 ננומטר. צלם תמונות של מישור יחיד ברזולוציה של 512 x 512 פיקסלים על-ידי לחיצה על לחצן הפילוס הרציף (ממוצע של 2 שורות) באמצעות יעדי 20X 0.1 NA air ו-40X 1.0 NA oil.
- השג לפחות עשרה שדות ראייה לכל מקטע לצורך ניתוח ונתונים עבור כל תוצאה (כלומר, 10 שדות ראייה בעוצמה גבוהה (HFOV) עבור הפקד, 10 עבור הדגימה המגורה וכו', עבור כל עכבר).
הערה: כדי לקבל מדגם מייצג של כל השדה, ניתן להשתמש במערכת מטריצה שבה השדה מחולק למקטעים שונים, ועבור כל מדגם שונה אותה מטריצה משמשת לבחירת שדות ראייה (למשל, ניתן לחלק את השדה ל-9 חלקים, ומהמרכז ומ-4 הפינות, שני HFOV נלקחים).