הכנת תחליב אנטיגן-אדג'ובנטי להשראת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית

תקציר

מקור: Bäckström, B. T. שיטת הומוגניזציה מהירה, פשוטה ומתוקננת להכנת תחליבים אנטיגנים/אדג'ובנטיים לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים טכניקת הומוגניזציה יעילה ליצירת תחליב אנטיגן-אדג'ובנטי כדי לגרום לאנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) במודל מורין. התחליב מכיל אנטיגן עצמי - גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (MOG) - בשלב המים, מוקף בשלב שמן רציף הכולל חיידק פתוגני בלתי פעיל. האמולסיה מבטיחה שחרור מתמשך של אנטיגנים לתגובה חיסונית ממושכת.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

הערה: זרימה סכמטית של השיטה מתוארת באיור 1.

1. הכנת החומר

הערה: הכינו את כל הריאגנטים במכסה מנוע סטרילי, ועלו ואחסנו בטמפרטורה שצוינה. ריאגנטים ניתן לאחסן עד 2 שנים מבלי לאבד את השפעתם.

1. הכינו CFA המכיל 20 מ"ג/מ"ל Mycobacterium tuberculosis כמתואר להלן.
   1. הוסף 100 מ"ג של M. tuberculosis H37RA מיובש בהקפאה (ראה טבלת חומרים) וחמישה חרוזי פלדה 3.2 מ"מ לצינור 7 מ"ל (ראה טבלת חומרים). נערו את הצינור בהומוגנייזר (ראו טבלת חומרים) למשך 60 שניות במהירות הגבוהה ביותר (5,000 סל"ד).
   2. מוסיפים 5 מ"ל של אדג'ובנט לא שלם של פרוינד (IFA) לצינור ומנערים שוב במשך 60 שניות במהירות הגבוהה ביותר. מעבירים את התרחיף של שחפת הומוגנית ב- IFA (כיום CFA) לצינור טרי עם פיפטה, משאירים את החרוזים מאחור, ומאחסנים ב -4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
2. הוסיפו מים אולטרה-טהורים לאבקה המיובשת בהקפאה של פפטיד MOG_35-55 (ראו טבלת חומרים) כדי לקבל ריכוז פפטיד סופי של 10 מ"ג/מ"ל. לעקר את התמיסה על ידי העברתה דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. להכין 60 μL aliquots ולאחסן ב -20 °C עד לשימוש.
   הערה: פפטיד MOG_35-55 המשמש לניסוי זה הוא בעל טוהר ImmunoGrade (~70%), הוא TFA-cleaved, מתמוסס בקלות במים, ומכיל C-terminal amide (-NH₂) כדי להגביר את יציבות vivo. אליציטוטים פפטידים מעולם לא הופשרו והוקפאו מחדש יותר מפעמיים, ואוחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

2. הכנת תחליבים CFA/פפטיד

1. חשב את כמות התחליב הדרוש לחיסון. בפרוטוקול סטנדרטי זה, כל עכבר מקבל 50 מיקרוגרם של MOG_35-55 פפטיד ו-300 מיקרוגרם של M. tuberculosis המפוזרים באדג'ובנט של פרוינד (CFA). ניתן לחשב את הסכום של כל מגיב (פפטיד MOG_35-55, PBS, CFA ו- IFA) הדרוש להכנת האמולסיות באמצעות קובץ משלים 1. תוספת של 20% מכלל הריאגנטים, כדי לפצות על אובדן קטן של תחליב, נכלל בחישוב.
   הערה: ערכת האמולסיה המסחרית (ראו טבלת חומרים) ששימשה במחקר זה כוללת צינור, מכסה בורג ובוכנה בנרתיק מעוקר. כל צינור של ערכת התחליב מכיל מקסימום של 9.6 מ"ל, מה שמאפשר להכין מזרקים בגודל 8 x 1 מ"ל המספיקים לחיסון 40 עכברים (או 80 עכברים אם משתמשים ב-100 מיקרוליטר תחליב לכל חיה).
2. הניחו את הצינור הסגור בבורג (מערכת התחליב המסחרית) ואת הריאגנטים לשימוש על קרח.
3. הוסף את רכיבי האמולסיה בסדר הבא באמצעי האחסון המחושבים בשלב 2.1: PBS, לאחר מכן הפפטיד, לאחר מכן M. tuberculosis ב- CFA, ולבסוף IFA.
4. סגור את הצינור עם המכסה בחוזקה על ידי הידוק ושחרור אותו מספר פעמים. נערו את הצינור במרץ במשך 5-10 שניות ביד כדי לערבב מראש את הריאגנטים.
5. מניחים את הצינור בהומוגנייזר הרועד ומהדקים אותו בעזרת המוט. הגדר את המהירות להגדרה הגבוהה ביותר ואת הזמן ל- 60 שניות. לאחר סיום הריצה, הניחו את הצינור על קרח למשך 3 דקות. חזור על ההפעלה פעם או שתיים נוספות עם אותן הגדרות.
6. צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם למשך דקה אחת כדי להסיר אוויר לכוד ולדחוס את התחליב
.
7. הסר את הפקק מהצינור, הכנס את הבוכנה לתוך הצינור ודחוף אותו מטה באיטיות עד שהוא מגיע לחלק העליון של האמולסיה. הסר את סגירת ההצמדה בתחתית הצינור על ידי סיבובו.
8. הסר את הבוכנה ממזרק הזרקה (1 מ"ל; ראה טבלת חומרים). מוסיפים מחט (רצוי 25-27 גרם) למזרק ההזרקה.
9. חברו את הקצה האחורי של מזרק ההזרקה למנעול הייעודי בתחתית הצינור ונעלו אותו בסיבוב קצר.
10. מעבירים את התחליב מהצינור למזרק ההזרקה על ידי דחיפת הבוכנה בעדינות. עצור כאשר התחליב מגיע לסיום 0.15 מ"ל של מזרק ההזרקה.
11. הפרידו את מזרק ההזרקה מהצינור והכניסו את הבוכנה בזהירות, תוך הקפדה שלא ייכנס אוויר למזרק. דוחפים את הבוכנה עד שהתחליב יוצא מהמחט.
    הערה: בשלב זה, חלק מהאמולסיה יכול לשמש לבקרת איכות (ראה שלב 3).
12. חזור על שלבים 2.8-2.11 עבור שאר התחליב הקיים בצינור.
    הערה: כדי למזער את הבזבוז של תחליבים CFA / אנטיגן יקרים, יש להשתמש מזרקים 1 מ"ל. ניתן להשתמש במזרקים אחרים המתאימים למנעול הייעודי בתחתית הצינור; עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להכין נפח גדול יותר של תחליב. ניתן לאחסן את תחליב הפפטיד CFA/MOG_35-55 בטמפרטורה של 4°C למשך עד 15 שבועות מבלי לאבד את יכולת השראת EAE שלו.

3. בקרת איכות של תחליב

1. מבחן טיפה: הוסף טיפה קטנה של התחליב לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל מלא 20 מ"ל של מים קרים. סגור את הצינור ונער אותו ביד למשך מספר שניות. הופעתן של טיפות זעירות וברורות מאשרת את היווצרותו של תחליב מים בשמן.
2. בחן את האמולסיה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
   1. כדי לנתח את גודלם של חלקיקי המים בשמן, הוסיפו טיפה זעירה (2-3 מיקרוליטר) של האמולסיה לשקופית מיקרוסקופ, מרחו אותה עם החלקת כיסוי, ואז דחפו חזק בתנועה סיבובית כדי לשטח את התחליב.
   2. בחנו את התחליב המרוח תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (ראו טבלת חומרים) בהגדלה של פי 400 והתמקדו בשדה עם חד-שכבה של האמולסיה. ודאו שחלקיקים אפורים/לבנים קטנים ואחידים נראים לעין (איור 2A).

תוצאות

איור 1: סכמטיות של תהליך הכנת התחליב באמצעות ערכת תחליב מסחרית. נעשה שימוש חוזר בנתון זה מ- Topping et al באישור.

איור 2: אפיון תחליבים המיוצרים בשיטות שונות. (A) תמונות מייצגות משלוש שיטות הכנה שונות: שיטת הומוגניזציה סטנדרטית, שיטת מזרק מסורתית ושיטת מערבולת. כמות קטנה של תחליב הונחה על מגלשת זכוכי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 מ"ל מזרק הזרקה	ב. בראון	9166017V
1 מ"ל מזרק הזרקה	סיגמא-אולדריץ'	Z683531
7 מ"ל צינורות ריקים עם כמוסות	ברטין-אינסטרומנטס	P000944LYSK0A.0	צינור 7 מ"ל
50 מ"ל צינור צנטריפוגה סטרילי	פישר סיינטיפיק	10788561	צינור 50 מ"ל
שמן מינרלי קל ומפזר	סיגמא-אולדריץ'	M8410	חנות ב- RT
ערכת תחליב	ברטין-אינסטרומנטס	D34200.10 ea	מכיל צינור, מכסה ובוכנה
האדג'ובנט של פרוינד לא שלם	סיגמא-אולדריץ'	F5506	יש לאחסן בטמפרטורה של +4 °C
מיקובקטריום שחפת, H37RA	פישר סיינטיפיק	DF3114-33-8	יש לאחסן בטמפרטורה של +4 °C
מיניליס-הומוגנייזר אישי	ברטין-אינסטרומנטס	P000673-MLYS0-A	רועד הומוגנייזר
MOG 35-55 פפטיד	Innovagen	לא ישים
מונטניד ISA 51 VG	ספיק	36362Z	אדג'ובנט שמן שאושר על ידי ה-FDA
פאל אקרודיסק מזרק מסננים 0.2 מיקרומטר	פישר סיינטיפיק	17124381	מסנן סטרילי
PBS, Ca2 + / Mg2+ חינם	תרמו פישר סיינטיפיק	14190144	PBS
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה	אולימפוס	BX40-B
חרוזי פלדה 3.2 מ"מ	פישר סיינטיפיק	NC0445832	Autoclave וחנות ב- RT