כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת עכבר
הערה: ההליך הבא, כולל הכנה וניתוח של בעלי חיים, ייקח 30-40 דקות. לפני הניתוח, הפעל את המיקרוסקופ וחמם את האינקובטור הסגור במיקרוסקופ ל -37 מעלות צלזיוס.
- בצע ניסויים על עכברי TcrdEGFP בני 8-10 שבועות על רקע C57BL/6, שהתקבלו מברנאר מליסן (INSERM, פריז, צרפת). על פי הנוהל שאושר על ידי IACUC, יש להרדים את העכבר על ידי הזרקת קטמין (120 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) בהתאם למשקל החיה. להעריך את רמת ההרדמה על ידי קצב נשימה (55-65 נשימות לדקה), צביטת בוהן ורפלקס palpebral.
- לאחר ההגעה להרדמה כירורגית, אבטחו את רגליו האחוריות של העכבר באמצעות סרט הדבקה לכרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף, אשר ניתן לפקח על ידי מדחום רקטלי. אם יש סימנים לכך שההרדמה פגה (למשל, קצב נשימה מוגבר, מצמוץ ו / או תגובת עוויתות שריר העין לרפלקס מישושי), יש לתת מחדש 50 מיקרוליטר קטמין/קסילזין בכל פעם עד שהעכבר טשטוש לחלוטין.
- הכן את הצבע הגרעיני על ידי דילול 50 μL של Hoechst 33342 (10 מ"ג / מ"ל) עם 315 μL של 0.9% מלוחים; הריכוז הסופי הוא 37.5 מ"ג / ק"ג בהתבסס על משקל העכבר (200 μL נפח משוער). לאחר שהעכבר מורדם, יש להזריק באיטיות את Hoechst באמצעות מזרק שחפת דרך הסינוס הוורידי הרטרו-אורביטלי.
הערה: המתן 1-2 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא כדי לאפשר לעכבר להסתגל לשינוי בנפח המחזור לאחר הזרקה רטרו-מסלולית.
- יש להניח כמות קטנה של חומר סיכה על העיניים כדי למנוע מהן להתייבש.
2. ניתוח עכבר: לפרוטומיה לחשיפת רירית המעי
- בצע חתך אנכי של 2 ס"מ דרך העור והצפק לאורך קו האמצע של הבטן התחתונה כדי להחצין את אזור המעי שיש להדמיה.
- באמצעות מלקחיים זוויתיים, בזהירות למשוך את cecum מתוך חלל הצפק ולזהות את האזור של המעי הדק להיות הדמיה. היזהר לא לקרוע כלי דם mesenteric במהלך תהליך זה. כדי למזער נזק או דימום פוטנציאליים, הימנעו מלתפוס או לצבוט את המעי במלקחיים.
- איתור אזור מתאים במעי הדק (2-3 ס"מ) לצורך הדמיה המכיל תכולת צואה מינימלית. בזהירות להחזיר את cecum ואת המעי הדק הנותר לתוך חלל הצפק, תוך השארת קטע עניין חיצוני.
הערה: הימנע מניקוב הצקום או הפרעה לכלי הדם המזנטריים במהלך שלב זה.
- הניחו שני זוגות מלקחיים משני צדי המזנטריה התחתונה בין כלי הדם, ושפשפו בעדינות את קצות המלקחיים זה בזה כדי ליצור חור בקרום (איור 1). זה יאפשר למחט לעבור דרך mesentery בעת סגירת חלל הצפק מתחת למעי.
- סגור את החתך תוך שמירה על לולאה של המעי חיצוני. בעזרת מלקחיים זוויתיים ומחט מעוקלת ומחודדת המחוברת לתפר בקוטר 5 ס"מ, חודרים לצד אחד של הצפק, עוברים דרך החור שנוצר בשלב הקודם, ומעלה דרך הצד השני של רירית הצפק. הניחו תפר אחד בחלק העליון, ותפר נוסף קרוב לחלק התחתון של החתך.
הערה: הימנע מפגיעה בכלי הדם במהלך שלב זה.
- חזור על תהליך זה כדי לסגור את העור מתחת ללולאת המעי, על ידי הנחת תפר אחד באמצע החתך, בין התפרים הקודמים בצפק הבסיסי.
הערה: חשוב להחצין רק את האזור שיש לצלם; זה יפחית תנועה חיצונית במהלך ההדמיה. הקפד להימנע מקשירת העורקים המזנטריים.
- השתמש electrocautery כדי לעשות קו של ניקוב לאורך הגבול anti-mesenteric. מיד לאחר הצריבה, יש למרוח כמה טיפות מים על פני השטח של המעי כדי למנוע נזק נוסף לרקמות כתוצאה מחום. יש למרוח עם מגבון כדי להסיר שאריות מים.
- חותכים חריץ אופקי קטן בקצה הדיסטלי של הרקמה הצרובה באמצעות מספריים של Vannas וממשיכים לחתוך לאורך הקו הצרוב לכיוון הקצה הפרוקסימלי של מקטע הרקמה החיצונית (כ -1.5 ס"מ אורך) כדי לחשוף את פני הרירית.
הערה: במידת הצורך, השתמש במלקחיים כדי להסיר בעדינות כל תוכן צואה עודף שנותר על פני הרירית החשופה.
- כסו את בטנו של העכבר במגבון לח כדי למנוע מהרקמה להתייבש. להעביר את העכבר למיקרוסקופ בכלי מכוסה.
3. רכישת תמונה על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב
- פיפטה 150 μL של 1 מיקרומטר AlexaFluor 633 ב HBSS על כיסוי זכוכית החליק תחתית של צלחת 35 מ"מ. מקם את העכבר כך שמשטח הרירית הפתוח יבוא במגע ישיר עם הכיסוי.
- הטו את ראש המיקרוסקופ לאחור והניחו את העכבר על הצלחת המכוסה על שלב ההדמיה באינקובטור שחומם מראש. לחלופין, כסו את העכבר בשמיכת חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
- הפעל תוכנת הדמיה. עוצמת העירור וזמן החשיפה עבור כל לייזר לא יעלו על 10-15 mW או 120-150 ms, בהתאמה, כדי למנוע photobleaching ולמזער את המרווח בין נקודות זמן. התאם את ממוצע המסגרת ל- "2" והפעל את פונקציית הרווח EM כדי להפחית רעשי רקע. בחר כיול אובייקטיבי של 63x כדי להבטיח מדידה נכונה של גודל הפיקסלים.
הערה: ההגדרות המפורטות לעיל נועדו לספק התייחסות ראשונית, אך ישתנו בהתאם לתצורות המיקרוסקופ הבודדות.
- באמצעות לייזר 405 ננומטר ומטרת אוויר 20x, דמיינו את הגרעינים כדי לאתר שדה של וילי חסר תנועה מורגשת או סחף בעין. הימנע מאזורים של תנועה מלאכותית עקב נשימה, פריסטלטיקה או פעימות לב.
- באמצעות סריקת XY, רשום את קואורדינטת XY של תחום העניין ועבור למטרה טבילת גליצרול 63X.
- ודא כי villi בשדה שנבחר יציבים על ידי רכישת תמונה חיה על ערוץ 405 ננומטר עד 1 דקה.
- בעת רכישת תמונה חיה בערוץ 405 ננומטר, התאם את המיקוד כדי למצוא את המישור האורתוגונלי ממש מתחת לקצה הווילוס. רכשו ערימות Z החל ממש מתחת לאפיתל קצה הווילוס במורד הווילוס עד שקשה לפתור את הגרעינים, בערך 15-20 מיקרומטר, באמצעות צעד של 1.5 מיקרומטר.
הערה: בהדמיה עם שלושה ערוצים (405, 488, 640 ננומטר) באמצעות זמני החשיפה שתוארו לעיל, ניתן לרכוש את כל שלושת הערוצים ברצף במרווחים של כ- 20 שניות.
- פתח את התוכנה במצב ניתוח, 3-5 דקות לאחר תחילת הרכישה, כדי לאשר את יציבות התמונה ואת תנועתיות γδ IEL . המשך לרכוש תמונות במשך 30-60 דקות עבור כל שדה של villi. הקלט 2-3 שדות עבור כל עכבר. בזמן ההדמיה, עקוב אחר העכבר כל 5 דקות.
