$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ייצור ואפיון LMPs
הערה: כדי למנוע זיהום, ודא שכל החומרים המשמשים בניסוי זה הם סטריליים או אוטוקלאביים. בצע את כל השלבים ב- RT בארון בטיחות ביולוגי בתנאים סטריליים, אלא אם צוין אחרת.
- גירוי ואיסוף חברי פרלמנט
- הפשיר aliquot של 10 מיליון תאי CEM T באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. יש לדלל בתווך המטופויטי מחומם מראש ללא סרום 10 מ"ל כגון X-VIVO, בצינור סטרילי של 15 מ"ל ובצנטריפוגה במהירות של 200 גרם x 5 דקות. שואפים את הסופרנאטנט ומרחפים תאים בתווך מחומם מראש של 5 מ"ל.
- מעבירים תאים לבקבוק תרבית רקמה T75 (לתאי תרחיף) עם 15 מ"ל תווך המטופויטי שחומם מראש כגון X-VIVO ודגרים במשך 4 ימים באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
- לאחר 4 ימים, מעבירים את כל מדיום התרבית והתאים לבקבוק תרבית רקמה T175 המכיל 100 מ"ל מדיום טרי. המשיכו לדגור על התאים במשך כ-72 שעות באותם תנאים עד שהם גדלו לצפיפות של 2 מיליון תאים/מ"ל.
- מחלקים תאים באופן שווה בין ארבע צלוחיות T175 שכל אחת מהן מכילה 150 מ"ל תווך טרי וממשיכים בתרבית תאים עד שהתאים גדלים (כ-48 שעות דגירה) לצפיפות של 2 מיליון למ"ל.
- לאסוף תאים מכל בקבוק על ידי צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ולהשהות מחדש 300 x 106 תאים לתוך בקבוק T175 חדש המכיל 150 מ"ל תווך טרי, כדי לשמור על צפיפות תאים 2 מיליון / מ"ל
.
- יש להוסיף אקטינומיצין D (מומס ב-DMSO במינון 2 מ"ג/מ"ל) למדיום בריכוז סופי של 0.5 מק"ג/מ"ל ולדגור במשך 24 שעות.
- מעבירים את כל מדיום התרבית לתוך צינורות חרוטיים של 50 מ"ל ומסובבים את התאים במהירות של 750 x גרם למשך 5 דקות. מעבירים את הסופרנאטנט לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל וצנטריפוגה במהירות של 1,500 x גרם למשך 15 דקות כדי להסיר שברי תאים גדולים.
- מעבירים את הסופרנאטנט לבקבוק של 250 מ"ל ואולטרה-צנטריפוגה בטמפרטורה של 12,000 x גרם למשך 50 דקות. משליכים את הסופרנאטנט ואוספים כדורים.
- יש לשטוף כדוריות מועשרות ב-LMPs עם PBS סטרילי של 40 מ"ל בצינור של 50 מ"ל באמצעות צנטריפוגה במהירות של 12,000 x גרם למשך 50 דקות. חזור על שלב זה פעמיים.
- אספו את סופרנאטנט השטיפה האחרון; הוא ישמש כבקרת רכב. להשעות את כדורי LMP ב 1 מ"ל של PBS ולהעביר אותם לתוך microtube סטרילי 1.5 מ"ל. Aliquot ולאחסן LMPs מבודדים ב -80 ° C (כדי למנוע מחזורי הפשרה חופשית מרובים).