כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. העשירו תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן בתאים מציגי אנטיגן מלאכותיים ננו-חלקיקיים מוכנים.
- בודד תאי T CD8+.
- הרדימו את בעלי החיים על ידי חשיפה לאיזופלורן ואחריה פריקת צוואר הרחם.
- הסר את הטחול ובלוטות הלימפה מעכברי בר מסוג C57BL/6j ומקם אותם בתמיסה של PBS. מייסרים את האיברים ומפזירים את התאים דרך מסננת תאים סטרילית של 70 מיקרומטר עם שטיפות תכופות של PBS.
- כדי לחסל תאי T שאינם CD8+, השתמש בערכת בידוד תאי T CD8+ ללא מגע ופעל לפי הוראות היצרן.
הערה: כל תנאי אנטיגן דורש לפחות 3 x 106 תאי CD8+ T.
- הוסף את aAPCs ננו-חלקיקים כדי להיקשר לתאי CD8+ T.
- לאחר הבידוד, יש להתרכז לנפח של 100 μL ב-PBS עם 0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) ו-2 mM EDTA.
- קבע את מספר aAPCs שיש להוסיף על ידי חישוב המבוסס על היחס של 1011 aAPC הקשורים ל- MHC-Ig וטעונים בפפטיד עבור כל 106 תאי CD8+ T.
- לדגור על חלקיקי aAPC ותאי CD8+ T למשך שעה אחת ב-4°C עם ערבוב מתמשך בצינור תחתון עגול סטרילי מפוליסטירן 5 מ"ל.
- הכינו תוספת מדיה וגורם גדילה של תאי T (TCGF) כדי לאלוט ולגדל תאי CD8+ T.
- עבור תוספת מדיה, יש להוסיף חומר RPMI 1640 מלא (עם גלוטמין) עם 1x חומצות אמינו לא חיוניות, 1 mM נתרן פירובט, 0.4x תמיסת ויטמין, 92 μM 2-mercaptoethanol, 10 μM ciprofloxacin ו 10% סרום בקר עוברי (FBS).
- כדי ליצור TCGF, עקוב אחר הפרוטוקולים שנקבעו.
הערה: TCGF הוא קוקטייל פנימי של ציטוקינים חיסוניים אנושיים אשר חיוני כדי לספק לתאי T אותות גירוי נוספים הדרושים לגדילה. TCGF יכול להיות מוחלף עבור ציטוקינים ממריצים ידועים של תאי T כגון IL-2, IL-7 או IL-15; עם זאת, כל אחד מהם עשוי לקטב את תגובת תאי T בהתאם.
- שטפו והעשירו את תערובת תאי ה-T של aAPC ו-CD8+.
- שטפו את aAPCs של חלקיקים מגנטיים, תחילה באמצעות מאגר PBS עם 0.5% BSA ו-2 mM EDTA, שנית באמצעות מדיה משלימה, ושלישית באמצעות מדיה משלימה עם 1% TCGF.
- Elute aAPCs ותאי T מועשרים CD8+ ב 500 μL של מדיה משלימה עם 1% TCGF.
- ספור את התאים באמצעות המוציטומטר וצלחת בצלחת 96 U-bottomed ב 160 μL לכל באר של מדיה משלימה עם 1% TCGF בריכוז של 2.5 x 105 CD8+ תאי T / מ"ל.
- אם אתה מבודד באמצעות aAPCs עם MHC-Ig טעון פפטיד בלבד על פני השטח (ללא אותות גירוי משותף), ולאחר מכן להשלים את שלב 4.5. אם מבודדים באמצעות aAPCs עם MHC-Ig טעון פפטיד על פני השטח ואותות גירוי משותף, המשך לשלב 5.
- הוסף את החלקיקים המגנטיים המצופים באותות גירוי משותף על פני השטח לחלק המועשר והוסף שדה מגנטי כדי לקבץ יחד את אותות הגירוי על פני השטח של תאי T.
- לשברים המועשרים, הוסף נוגדן מעורר שווה משקל (או יותר, תלוי בסעיף היישום - ראה על תכונות aAPC לשליטה) למספר MHC-Ig טעון פפטיד על החלקיק.
- אפשר לחלקיקים מגנטיים קו-סטימולטוריים להיקשר לתאי T מועשרים CD8+ למשך שעה אחת ב-4°C.
- הוסף שדה מגנטי על ידי מיקום לוח התרבית בין שני מגנטים דיסק ניאודימיום N52 באורך 1.9 ס"מ (0.75 אינץ ').
הערה: מגנטים דיסק N52 יש שדה חזק מאוד. יש להקפיד לאחסן אותם עם ספייסרים בין מגנטים, שכן קשה להסיר אותם אחד מהשני כאשר מניחים אותם על לוחות התרבית. כדי למזער את הידבקות המגנטים לרכיבי המתכת של האינקובטור, הניחו אותם במיכלי קלקר של צינור חרוטי בנפח 50 מ"ל הן בחלק התחתון והן בחלק העליון.
2. הרחב וזהה תאי T CD8+ ספציפיים לאנטיגן עם ננו-חלקיקים מוכנים תאים מציגי אנטיגן מלאכותיים
- הוסף את צלחת הבאר 96 U עם aAPCs ותאי T CD8+ באינקובטור לח 5% CO2, 37 ° C למשך 3 ימים. ביום השלישי, הזינו את התאים ב-80 מיקרוליטר לבאר של תוספת מדיה עם 2% TCGF והחזירו אותם לאינקובטור עד יום 7.
- ביום 7, קצרו את התאים המגוריים לתוך צינור תחתון עגול של 5 מ"ל לספירה.
- לאחר שכל התמיסה נקטפת, סובב את התאים שנקטפו כדי להשהות מחדש ב 0.5 מ"ל של PBS עם 0.05% נתרן אזיד ו 2% FBS. לספור תאים קיימא על ידי צביעה עם כחול טריפאן לסמוך על המוציטומטר.
- הסר 50,000-500,000 תאים שנספרו לשני צינורות תחתונים עגולים חדשים של 5 מ"ל לצביעה ספציפית לאנטיגן. צינור אחד ישמש לכתם הפפטיד הקוגנטי-MHC, והצינור השני ישמש לכתם הלא קוגנטי לקביעת צביעת רקע.
- הוסף 1 מיקרוגרם של MHC-Ig ביוטינילציה לצינורות הקוגנטיים והלא קוגניטיביים המתאימים ב-100 μL של PBS עם 0.05% נתרן אזיד ו-2% FBS עם אלופיקוציאנין (APC)-מצומד עכבר CD8a, שיבוט 53-6.7 (יחס דילול של 1:100) למשך שעה אחת ב-4°C.
- הוסף סטרפטאבידין משני וכתם מת חי. שטפו את עודפי MHC-Ig עם PBS באמצעות צנטריפוגה. לאחר מכן הכתימו את כל הדגימות ביחס של 1:350 של סטרפטאבידין עם תווית פיקואריתרין (PE) ויחס של 1:1000 של כתם תאים מתים ירוק חי/מת הניתן לתיקון למשך 15 דקות ב-4°C.
- קרא את כל הדגימות על ציטומטר זרימה כדי לקבוע את הספציפיות ואת מספר התאים הספציפיים לאנטיגן.
- שטפו עודפי כתמים משניים וחיים/מתים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש עם 150 μL של חיץ PBS עם 0.05% נתרן אזיד ו-2% FBS לקריאה על ציטומטר זרימה.
- קבע את המספר והאחוז של תאים ספציפיים לאנטיגן באמצעות תוכנה לניתוח נתונים.
- כדי לקבוע את אחוז התאים הספציפיים לאנטיגן, השתמש בשערים הבאים בסדר המתאים live+, לימפוציטים+ (פיזור קדימה לפי פיזור צדדי), CD8+ ודימר+. קבע את שער Dimer+ על-ידי השוואת הכתם הלא-קוגנטי לכתם הקוגנטי.
- קבע את אחוז התאים הספציפיים לאנטיגן בדגימה על-ידי הפחתת אחוז Dimer+ של כתם MHC-Ig הקוגניטיבי מכתם MHC-Ig שאינו קוגנטי.
- באמצעות אחוז זה של תאים ספציפיים לאנטיגן, הכפילו אותו במספר התאים שנספרו, והניבו את מספר התאים הספציפיים לאנטיגן כתוצאה מהעשרה והתפשטות.
הערה: יהיה צורך להגדיר פיצוי על ציטומטר הזרימה מכיוון שיש חפיפה ספקטרלית עם הפלואורופורים המשמשים בלוח זה.
