טכניקה לבידוד תאי פיטום ראשוניים מחלל הצפק המורין

תקציר

מקור: Tsvilovskyy, V., et al. בידוד תאי פיטום שמקורם בצפק והאפיון התפקודי שלהם עם Ca²⁺-imaging and degranulation assays. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים שיטת שטיפת הצפק לבידוד תאי פיטום בוגרים מסוג רקמת חיבור מחלל הצפק של עכברים בוגרים. עם בידוד תערובת של תאי חיסון ראשוניים מחלל הצפק, מתבצעת התרבות סלקטיבית של תאי פיטום בתנאי תרבית מתאימים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בידוד PMC על ידי שטיפה intraperitoneal

1. לפני בידוד התא, הכינו את החומרים המפורטים בטבלה 1.
2. השתמשו בעכברים זכרים בני 8 עד 14 שבועות לבידוד PMC. הרדימו עכבר על ידי שאיפת_CO2, ואשרו את המוות על ידי אובדן רפלקסים. רססו את העכבר באתנול 70% וקיבעו אותו על גוש קצף באמצעות פינים (הצד הגבי כלפי מטה). הסר את העור הגחוני של העכבר באמצעות מספריים קהות שוליים. הימנע מפגיעה בחלל הצפק.
   הערה: אנו משתמשים בדרך כלל בפרוטוקול זה עבור עכברים עם רקע גנטי של זן C57BL/6N.
3. להזריק 7 מ"ל של מדיום סל"ד קר כקרח ו 5 מ"ל של אוויר בחלל הצפק באמצעות מזרק 10 מ"ל מצויד מחט 27 גרם. לדחוף את המחט בזהירות בצפק ולא לנקב שום איברים. השתמש נקודה באזור של שומן epididymal כדי להפחית את הסיכון של ניקוב איברים.
4. לאחר ההזרקה, נערו את העכבר למשך דקה אחת כדי לנתק את תאי הצפק למדיום הסל"ד. אין לנער את העכבר חזק מדי, כדי למנוע פגיעה באיברים הפנימיים וזיהום חלל הצפק בדם.
5. עשו שימוש חוזר במזרק 10 מ"ל על ידי הצטיידותו בצינורית 20 G חדשה. הזיזו את האיברים הפנימיים לצד אחד על ידי הטיית גוש הקצף וטפיחה עדינה על הספסל כדי להקל על השאיפה הבינונית מהצד השני. הכנס מחט 20 גרם, שיקוע כלפי מעלה, ושאפו את הנוזל מהבטן בעדינות ובאיטיות (~ 0.5 מ"ל לשנייה) כדי למנוע סתימה על ידי האיברים הפנימיים. לאסוף כמה שיותר נוזלים (בדרך כלל 5-6 מ"ל).
6. הסר את המחט מהמזרק והעבר את תרחיף התאים שנאסף לצינור איסוף על קרח. יש להשליך צינורית דגימה אם קיים זיהום דם גלוי.
7. צנטריפוגה את הצינורות עם תרחיף התא ב ~ 300 x גרם במשך 5 דקות. מתחת למכסה מנוע סטרילי שואפים הסופר-נטנט. עבור כל עכבר, לשלב את כדורי הדגימה ב 4 מ"ל של קר (4-10 ° C) PMC בינוני ולהעביר את תרחיף התא 25^ס"מ 2 צלוחיות תרבית. הוסף את גורמי הגדילה IL-3 ו- SCF לריכוזים הסופיים של 10 ננוגרם/מ"ל ו- 30 ננוגרם/מ"ל, בהתאמה. מניחים את הבקבוק המכיל את התאים באינקובטור (37 מעלות צלזיוס ו -5% CO₂) ודגרים במשך ~ 48 שעות עד להליך הבא.

טבלה 1: חומרים לשלב 1.

1	קרח
2	מזרקים 10 מ"ל
3	27 גר' מחטים
4	20 גר' מחטים
5	בלוק קלקר וסיכות
6	צינורות איסוף (50 מ"ל צינורות צנטריפוגות פלסטיק)
7	70% אתנול
8	RPMI בינוני (מקורר מראש ונשמר על קרח)
9	PMC בינוני: RPMI בינוני + 20% FCS (סרום עגל עובר) + 1% תמיסת סטרפטומיצין פניצילין (Pen-Strep)
10	מלח חוצץ פוספט של Dulbecco - DPBS (ללא Ca2+ ו- Mg2+)
11	צלוחיות תרבות (25 ס"מ)
12	פתרונות מלאי גורמי צמיחה (IL-3: 1 מיקרוגרם/μL; SCF: 2.5 מיקרוגרם/מ"ל)
13	פיפטות סרולוגיות (10 מ"ל)
14	פיפטות קצוות סטריליים (20-200 μL)
15	המוציטומטר
16	צנטריפוגת ספסל
17	מספריים ומלקחיים
18	תא CO2 לעכברים
19	מכסה מנוע סטרילי פתוח
20	מכסה מנוע סטרילי סגור
21	אינקובטור תאים (37°C ו-5% CO2)
22	פיפטות העברה (20–200 μL)

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סל"ד בינוני	תרמו סיינטיפיק	21875034
DPBS	סיגמא-אולדריץ'	14190144
FCS	תרמו סיינטיפיק	₪2215
IL-3	מערכות מו"פ	403 מ"ל
SCF	תרמו סיינטיפיק	PMC2115
פנסטרפ	תרמו סיינטיפיק	15140122
צלוחיות תרבות (25 ס"מ)	גריינר ביו-וואן	69160
15 מ"ל צינורות צנטריפוגות פלסטיק	זארשטדט	6,25,54,502
צנטריפוגת ספסל	הראיוס	Megafuge 1.0R