כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. ייצור מכשירים וליתוגרפיה רכה
הערה: טכניקות סטנדרטיות של ליתוגרפיה רכה שימשו ליצירת מיקרו-ערוץ פולידימתילסילוקסאן (PDMS).
- ערבבו את קודמן PDMS ביחס של 10:1 של בסיס וחומר ריפוי.
- שפכו 30 גרם של תערובת קודמן PDMS לתוך תבנית אלומיניום מיקרו-מכונה (ראו איור 1 עבור ממדים) ו-20 גרם של תערובת קודמן PDMS לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ.
הערה: צלחת הפטרי משמשת להכנת הסרט העבה של PDMS (~ 3 מ"מ) עבור השכבה התומכת. השכבה התומכת של PDMS מספקת תכונות פני שטח פיזיקליות אחידות בכל המיקרופלואידיקה. לחלופין, ניתן להשתמש בסרט PDMS דק על מגלשת הזכוכית. תבנית האב עם מידות ערוץ ספציפיות תוכננה ויוצרה על ידי מיקרו-כרסום על יריעת האלומיניום. התעלה הספירלית ששימשה במחקר זה הייתה מיקרו-ערוץ ספירלי בעל 8 לולאה עם כניסה אחת ושני שקעים, כאשר הרדיוס גדל מ-8 מ"מ ל-24 מ"מ להפרדה יעילה מבוססת גודל.
- הכניסו את התבנית ואת צלחת הפטרי למייבש ואקום כדי להוריד את הגז עד שלא נראות בועות על פני השטח, בדרך כלל 5 - 10 דקות. השתמשו בשואב אבק ביתי למייבש.
- שחררו את הוואקום והכניסו את התבנית ואת צלחת הפטרי לתנור בטמפרטורה של 90°C למשך שעה <>
הערה: ניתן להשתמש בפלטה חשמלית או בכלי חימום אחרים במקום בתנור.
- מוציאים את התבנית ואת צלחת הפטרי מהתנור ומצננים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- גזור בזהירות את קווי המתאר ונקב את חורי הגישה לנוזל במכשיר באמצעות פאנצ'ר 2 מ"מ.
הערה: גודל האגרוף יכול להשתנות בהתאם לגודל הצינור או מדריך הנוזל.
- הדביקו סרט בצד התעלה של המכשיר ובסרט עבה של PDMS, וקילפו בזהירות עם מלקחיים כדי להסיר אבק.
- טפלו גם בצד התעלה של המכשיר וגם ב-PDMS רגיל עם פלזמה של אוויר והתחברו לשכבה התומכת המוכנה של PDMS רגיל (איור 1A).
- הניחו את השבב על מגלשת זכוכית בגודל 50 מ"מ x 70 מ"מ והכניסו אותו לתנור בטמפרטורה של 70°C למשך 30 דקות לפחות כדי לשפר את חוזק ההדבקה.
2. איסוף הפרשת קנה הנשימה מחולים מונשמים מכנית
הערה: ניתן לקבל הפרשות קנה הנשימה מחולים מונשמים מכנית במהלך טיפול שגרתי רגיל בדרכי הנשימה באמצעות פרוטוקול שונה משיטות קונבנציונליות כדי להתאים לחולה סטנדרטי, מבוגר מונשם. הדגימות הוסרו מהזיהוי ונשלחו מיד לעיבוד.
- אם ניכרת שאיפת קנה הנשימה, יש להשתמש בצנתר כדי לחלץ הפרשות מדרכי הנשימה.
- מקדמים את הצנתר בזהירות באמצע הדרך לתוך הצינור האנדוטרכאלי ומחדירים 5 מ"ל של 0.9% מלח רגיל סטרילי ממזרק 10 מ"ל ממולא מראש.
- כאשר הצנתר מתקדם באופן מלא, או כאשר ההתנגדות מתקיימת, שואפים את ההפרשות ואוספים אותן לתוך מיכל איסוף כיח סטרילי.
- לאסוף 10 מ"ל של הפרשות קנה הנשימה במיכל כיח סטרילי ומניחים אותו על קרח. שלח דוגמאות באופן מיידי לעיבוד.
3. הכנת דגימת הפרשת קנה הנשימה
הערה: כל הניסויים חייבים להתבצע תחת ארון בטיחות ביולוגית עם ציוד מגן אישי מתאים.
- יש לפזר 1 מ"ל של דגימות הפרשת דרכי הנשימה ב-9 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) באמצעות מזרק פלסטיק 10 מ"ל (לדילול פי 10). השתמש פיפטה קהה כדי הומוגניזציה של דגימת ריר.
- מסננים את המדלל עם מסננת תאי ניילון בגודל 40 מיקרומטר כדי להסיר גושים גדולים או קרישי דם, שיכולים לחסום את חור הגישה למיקרופלואידיקה או את התעלה. הניחו את הדגימה על הקרח לאחר העיבוד.
- פזרו את המדלל של כל דגימה באמצעות מאגר PBS בנפח 100x, והתוצאה היא תרחיף מדולל פי 1,000. הניחו את הדגימה על הקרח במהלך כל פעולת הדיסוציאציה.
4. מערך ניסיוני
הערה: כל הניסויים חייבים להתבצע תחת ארון בטיחות ביולוגית עם ציוד מגן אישי מתאים.
- הרכיבו את שבב PDMS עם מדריך הנוזל כדי להחיל זרימה אחידה על כל אחד מארבעת המיקרו-ערוצים הספירליים (איור 1B).
הערה: ארבעה ערוצים שימשו להגדלת התפוקה על ידי מקביליות, כמו גם אופטימיזציה של נפח וצפיפות התא של ההשעיה המתקבלת. המדריך הנוזלי מתוכנן ומיוצר עם מדפסת תלת-ממד מסוג סטריאוליתוגרפיה עם שרף שקוף. הכניסה ויציאת היציאה של מדריך הנוזלים משתמשות במחברי Luer לנשים לצורך חיבור קל ואיטום יציב במהלך הפעולה.
- חבר מחבר Luer זכר בגודל 1/16 אינץ' לכניסה, לשקע הקיר הפנימי (IW) וליציאת היציאה בדופן החיצונית (OW) של מדריך הנוזלים וחבר צינור סיליקון למתלה הדגימה.
- הכנס קצוות קהים לכל קצה של הכניסה ושקעים כדי להגיע לתחתית מאגר הדגימה.
- חבר את המשאבה הפריסטלטית עם צינורות הכניסה.
- הניחו את קצה צינורות הכניסה וצינורות יציאת IW במאגר הדגימה ומקמו את קצה צינורות יציאת ה-OW במאגר הפסולת (איור 1C, D).
- מניחים את הצינור 50 מ"ל של PBS מסונן ללא סידן ומגנזיום במאגר הדגימה.
- התחל לשאוב בקצב זרימה נמוך (~ 1 מ"ל / דקה) כדי להפעיל את המכשיר.
הערה: כאשר בועות נלכדות בתעלה, דחפו את החלק העליון של הערוץ עם הפינצטה כדי לערער את היציבות ולחסל בועות אוויר. כאשר המכשיר מלא במלואו בתמיסת חיץ, שנה את צינור PBS כדי להכין את צינור הדגימה של הפרשת דרכי הנשימה.
- כאשר הדגימה ממוקמת במאגר הדגימה, הפעילו את המשאבה הפריסטלטית וקבעו את קצב הזרימה על 4 מ"ל/דקה (איור 1C, D).
- כאשר נפח הדגימה מגיע לנפח המיועד (~1 מ"ל), הפסק את הפעולה ונתק את צינורות הסיליקון.
הערה: השיטה המוצעת יעילה יותר בהפחתת נפח גדול של מדלל (>50 מ"ל) לנפח צינור מיקרו-צנטריפוגה (~1 מ"ל) (איור 2).
