תיוג לימפוציטים Murine T Helper באמצעות נוגדנים חד-שבטיים רדיואקטיביים

תקציר

מקור: Hoffmann, S. H. L., et al., Murine Lymphocyte Labeling by ⁶⁴Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT. J. Vis. Exp. (2017)

בסרטון זה, אנו מדגימים את תיוג הרדיו התוך-תאי של תאי T עוזרים באמצעות נוגדנים חד-שבטיים מצומדים באיזוטופים רדיואקטיביים להדמיית טומוגרפיה לא פולשנית של פליטת פוזיטרונים.

פרוטוקול

1. cOVA-TH1 תיוג רדיו סלולרי

הערה: ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb יוחלו על תאי cOVA-TH1 בתרבית כדי לאפשר תיוג רדיואקטיבי תוך תאי.

1. עבור תיוג רדיו של תאי cOVA-TH1, צייר 37 MBq של ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb עם תווית רדיו במזרק ללא נפח מת באמצעות כיול מנה. הוסף 1 מ"ל מלח כדי לקבל פתרון של 37 MBq/mL.
2. להשהות cOVA-TH1 תאים בתווך ב 2 x 10⁶ תאים / מ"ל ולהוסיף 0.5 מ"ל של תרחיף התא לכל באר בצלחת 48 באר.
3. הוסף 20 μL של פתרון 37 MBq/mL ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb טרי מוכן לכל באר של צלחת 48 באר. היחס הסופי עבור התיוג הוא 0.7 MBq לכל 10⁶ תאים בנפח של 520 μL. לדגור ב 37 ° C ו 7.5% CO₂ במשך 30 דקות.
4. לאחר הדגירה, בזהירות להשעות מחדש את התאים בכל באר ולהעביר את השעיית התא מן צלחת 48 באר לתוך צינור מכסה בורג 50 מ"ל. כדי למזער את אובדן התאים, שטפו היטב כל אחד מהם במדיום שחומם מראש.
5. צנטריפוגו את תרחיף התאים cOVA-TH1 ב 400 x גרם במשך 5 דקות, להשליך את supernatant, ולהשהות מחדש את התאים ב 10 מ"ל PBS שחומם מראש. הסר aliquot של השעיית התא לספירת תאים. חזרו על שלב הכביסה.
6. ספירת תאי cOVA-TH1 ברי קיימא בדילול מתאים עם צביעה כחולה טריפאן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מודול עבודה 64Cu	WKL	בהתאמה אישית	ייצור 64Cu
כיול מינון	קפינטק	CRC-25R
ציקלוטרון PETtrace	ג'נרל אלקטריק מערכות רפואיות
DOTA-NHS	מקרוציקליים	B-280
נוגדן נגד cOVA-TCR (KJ1-26)		מבודד מתרבית תאי היברידיומה	DOTA-צימוד
נא2HPO4	סיגמא-אולדריץ'	71633	DOTA-צימוד
H+ צ'לקס 100	סיגמא-אולדריץ'	C7901	DOTA-צימוד
יחידת סינון Amicon Ultra-15	מרק מיליפור	UFC910008	DOTA-צימוד
Rotipuran מים אולטרה טהורים	קרל רות'	HN68.3	DOTA-צימוד
אמוניום אצטט	סיגמא-אולדריץ'	32301	DOTA-צימוד
PBS	אוניברסיטת טובינגן		DOTA-צימוד
מיקרו ביו-ספין P-6 עמודה	מעבדות Bio-Rad	7326221	DOTA-צימוד
נתרן ציטראט	סיגמא-אולדריץ'	71497	DOTA-צימוד
ציקלון פלוס PhosphorImager	פרקין-אלמר	L2250116	DOTA-צימוד
DMEM	מרק מיליפור	102568	מרכיב עבור T תא בינוני
FCS	מרק מיליפור	S0115/1004B	מרכיב עבור T תא בינוני
נתרן פירובט	מרק מיליפור	L0473	מרכיב עבור T תא בינוני
חומצות אמינו MEM	מרק מיליפור	K0293	מרכיב עבור T תא בינוני
HEPES	מרק מיליפור	L 1613	מרכיב עבור T תא בינוני
פניצילין/סטרפטומיצין	מרק מיליפור	A2212	מרכיב עבור T תא בינוני
0.05 מ"מ 2-β-מרקפטואתנול	סיגמא-אולדריץ'	M3148	מרכיב עבור T תא בינוני
עכברי DO11.10		גידול בבית	תרבית תאי TH1
DPBS	גיבקו	14190144	תרבית תאי TH1
מסננת תאים 40 מיקרומטר	קורנינג	352340	תרבית תאי TH1
ACK Lysing Buffer	לונזה	10-548E	תרבית תאי TH1
CD4 MicroBeads, עכבר	Miltenyi ביוטק	130-097-145	תרבית תאי TH1
מפריד QuadroMACS	Miltenyi ביוטק	130-090-976	תרבית תאי TH1
עמודת LS	Miltenyi ביוטק	130-042-401	תרבית תאי TH1
נוגדן נגד CD4 (Gk1.5)		מבודד מתרבית תאי היברידיומה	תרבית תאי TH1
נוגדן נגד CD8 (5367.2)		מבודד מתרבית תאי היברידיומה	תרבית תאי TH1
נוגדן נגד חולדות (MAR18.5)		מבודד מתרבית תאי היברידיומה	תרבית תאי TH1
ארנב משלים MA	tebu-Bio	CL3221	תרבית תאי TH1
נוגדנים נגד IL-4 (11B11)		מבודד מתרבית תאי היברידיומה	תרבית תאי TH1
cOVA 323-339-פפטיד	EMC-micro-collections	הזמנה מותאמת אישית	תרבית תאי TH1
CPG1668-אוליגונוקלאוטידים	Eurofins MWG Operon	הזמנה מותאמת אישית	תרבית תאי TH1
IL-2	נוברטיס	65483-116-07	תרבית תאי TH1
צלחות 96 בארות	גריינר	655180	תרבית תאי TH1
צלחות 24 בארות	גריינר	662160	תרבית תאי TH1
בקבוק תרבית תאים	גריינר	660175	תרבית תאי TH1
צלחות 48 בארות	גריינר	677 180	תיוג תאים
Gammacell 1000	Theratronics הטוב ביותר	באמצעות חקירה
גולמאי RT225	גולמאי	באמצעות חקירה
כחול טריפאן	מרק מיליפור	L6323	הערכה חוץ גופית