טכניקת In Vitro להבדיל בין GM-CSF המייצרים תאי T מסייעים לבין תאי T נאיביים

תקציר

מקור: Lu, Y., et al. התמיינות חוץ גופית של תאי T Helper (T_HGM) המייצרים גרנולוציטים-מקרופאגים-מושבה-מעוררים.J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים את התמיינות החוץ גופית של גרנולוציטים-מקרופאגים-גורם מגרה מושבה או תאי T מסייעים מייצרי GM-CSF (T_HGM). תאי T נאיביים מבודדים עוברים גירוי לצורך התמיינות ל-T_HGM, אשר מאושר על ידי זיהוי ייצור GM-CSF תוך-תאי גבוה וביטוי נמוך של ציטוקינים ספציפיים אחרים לתאי T עוזרים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. מגיב והכנת חומרים

1. הכינו 500 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) המכיל 2% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1 mM חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA).
   הערה: שמור את החיץ על קרח לאורך כל ההליך לקבלת תוצאות אופטימליות.
2. הכן 50 מ"ל של מדיית RPMI מלאה המכילה RPMI 1640, 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. השתמש במדיית RPMI מלאה המכילה 50 מיקרומטר β-מרקפטואתנול עבור התמיינות תאי T_HGM. הוסיפו את β-מרקפטואתנול למכסה אדים.
3. הכן 7.5 מ"ל של תערובת נוגדנים נגד CD3e על ידי דילול מלאי מרוכז נגד CD3e ל -3 מיקרוגרם / מ"ל ב- PBS. מצפים צלחות 48 באר על ידי הוספת 150 μL של תערובת נוגדנים לכל באר לדגור את הצלחת ב 37 ° C לפחות 1 שעה, או ב 4 ° C לילה.
4. לעקר זוג מספריים ומלקחיים ולשמור אותם 70% אתנול בין נתיחות.

2. הכנת טחול מורין

1. יש להרדים את העכבר (בן 6-8 שבועות) באמצעות חנק_CO2 או פריקת צוואר הרחם שאושר על ידי המוסד. רססו את העכבר באתנול 70% והרכיבו אותו על בלוק פוליסטירן על גבו. העבר את העכבר לארון בטיחות ביולוגי כדי להמשיך בשלבים הבאים.
2. החזיקו את העור בעזרת זוג מלקחיים וחתכו את העור מתחת לכלוב הצלעות בצד שמאל למשך כ-4 ס"מ, בעזרת זוג מספריים. פתח את שק הצפק כדי לחשוף את הטחול והשתמש במלקחיים סטריליים כדי לחלץ את הטחול.
3. הניחו מסננת תאים של 70 מיקרומטר על צינור של 50 מ"ל והרטיבו אותה מראש עם 2 מ"ל של חיץ. מניחים את הטחול על מסננת התא (2-3 טחול למסננת תא אחד) ומייסרים אותם באמצעות קצה בוכנה של מזרק 5 מ"ל.
4. שטפו את המסננת ואת הצינורית מספר פעמים עם 1-2 מ"ל של מאגר בידוד תאים עד שכל התאים נשטפים לתוך הצינור. השליכו את מסננת התאים וצנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 350 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C. השליכו את הסופר-נטנט.
5. יש להשהות מחדש את כדורית התא עם 5 מ"ל של חיץ ליסינג אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) קר (4°C) (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0.1 mM Na₂EDTA; pH 7.2-7.4) ולערבב אותם בעדינות במשך 2 דקות. הוסף 10 מ"ל של מדיה RPMI מלאה כדי לנטרל את מאגר ACK ומיד צנטריפוגה את התאים ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant לאחר הצנטריפוגה.

3. בידוד תאי T CD4⁺ באמצעות מיקרו-כדוריות CD4 מגנטיות ועמודת הפרדת תאים

1. השהה מחדש את גלולת התא ב -5 מ"ל של מאגר בידוד תאים. סנן את מתלה התא באמצעות מסנן קדם-הפרדה (30 מיקרומטר) לתוך צינור חדש של 15 מ"ל כדי להסיר לכלוך.
2. קח 10 μL של מתלה התא ולבצע דילול 10x על ידי הוספת 90 μL של החיץ. קח 10 μL של תרחיף התא המדולל וערבב אותו עם 10 μL של כחול טריפאן לספירת תאים. ספור את התאים בהמוציטומטר כדי לקבוע את התשואה של תאים קיימא.
3. צנטריפוגה את התאים ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant.
4. להשהות מחדש את התאים ב 90 μL של חיץ לכל 10⁷ תאים. הוסף 10 μL של מיקרו-כדוריות CD4 מגנטיות לכל 10⁷ תאים. לדגור על התאים במשך 15 דקות ב 4 ° C. לקבלת תוצאות מיטביות, יש לערבב את תרחיף התאים בעדינות כל 5 דקות במהלך הדגירה.
5. בזמן שהתאים דוגרים, הניחו עמוד הפרדה על המעמד המגנטי. הרטיבו מראש את העמוד עם 2 מ"ל חיץ.
6. בסוף דגירה התא / חרוז, לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של חיץ וצנטריפוגה אותם ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant.
7. השהה מחדש את התאים ב- 1 מ"ל של מאגר, טען את הדגימה לעמודת הפרדת התאים ואפשר לה לזרום דרכה. השתמש בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל כדי לאסוף את החלק של תא CD4. הוסף 1 מ"ל של חיץ כדי לשטוף את המאגר לפני שהוא יבש. חזרו על שלב הכביסה 2x.
8. הסר את עמוד הפרדת התאים מהמעמד המגנטי והנח אותו על צינור צנטריפוגה חדש בנפח 15 מ"ל. הוסף 2 מ"ל של מאגר בידוד תאים לעמודת הפרדת התאים והפעל את הבוכנה בחוזקה כדי לאלץ את התאים לצאת מהעמודה.
9. צנטריפוגה את השבר ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי לקבל תאי CD4⁺. השליכו את הסופרנטנט.

4. טיהור תאי T נאיביים CD4⁺ (CD4⁺CD25-CD44^loCD62L^hi) על ידי מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות והתמיינות T_HGM

1. להשעות מחדש את גלולת התא CD4⁺ המתקבל ב 500 μL של חיץ. ערבבו את התאים עם תערובת נוגדנים מצומדים פלואורסצנטית המכילה CD4-PerCp (2.8 מיקרוגרם/מ"ל), CD44-APC (2.4 מיקרוגרם/מ"ל), CD25-PE (2 מיקרוגרם/מ"ל) ו-CD62L-FITC (10 מיקרוגרם/מ"ל) (טבלה 1). לדגור על התאים על קרח במשך 20-30 דקות, תוך הגנה עליהם מפני אור.
   הערה: ריכוזי הנוגדנים הותאמו בעבר במעבדה. מספר הנוגדנים הרשום הוא עבור תאים מ 1-2 עכברים.
2. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של חיץ צנטריפוגה התאים ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
3. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של חיץ. סנן שוב את התאים באמצעות רשת ניילון.
4. העבר את מתלה התא לצינור FACS למיון תאים. צפה מראש את צינורות FACS האוסף עם 500 μL של חיץ.
5. קבל CD4 ⁺ CD25-CD44^loCD62L^היי אוכלוסייה (של תאי CD4⁺ T נאיביים) על ידי מיון FACS. שער על CD4 ⁺ CD25^- תחילה, ולאחר מכן בחר CD44^loCD62L^{תאי היי} מאוכלוסייה זו.
6. אספו את שברי תאי CD4⁺ T התמימים לתוך צינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל. צנטריפוגה את התאים ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant.
7. השהה מחדש את תאי ה- CD4⁺ T התמימים בריכוז של 106 תאים / מ"ל במדיית RPMI מלאה המכילה 50 מיקרומטר β-מרקפטואתנול.
8. שאפו את הנוגדנים נגד CD3e המשמשים לציפוי מקדים בצלחת 48 בארות. זרע 0.25 מיליון תאים (250 מיקרוליטר) בכל באר עם IL-7 (2 ננוגרם/מ"ל), אנטי-CD28 (1 מיקרוגרם/מ"ל) ואנטי-IFNγ (10 מיקרוגרם/מ"ל) (טבלה 1).
   הערה: ריכוזי הציטוקין והנוגדנים הותאמו בעבר במעבדה להתמיינות תאי T_HGM.
9. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 3 ימים. אין לשנות את המדיום במהלך הדגירה.

5. ניתוח תאי העכבר T_HGM שנוצרו במבחנה

1. באמצעות מיקרוסקופ, לבדוק את התמיינות התא 3 d לאחר ההתמיינות. קצור את התאים וצנטריפוגה אותם ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשטוף את התאים 2x עם מדיית RPMI מלאה.
   הערה: תאים ממוינים גדולים יותר בגודלם מתאי T נאיביים מסוג CD4⁺.
2. להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של מדיה RPMI מלאה. קח 10 μL של תרחיף התא ולערבב אותו היטב עם 10 μL של כחול טריפאן כדי לקבוע את מספר התא עם hemocytometer. חלק תאים ממוינים לשלושה שיקויים לרסטימולציה וניתוח.
   הערה: צביעת ציטוקינים תוך תאית דורשת ≥0.5 מיליון תאים.
3. לצביעת ציטוקינים תוך-תאיים, עוררו מחדש את התאים עם פורבול 12-מיריסטט 13-אצטט (PMA) (100 ננוגרם/מ"ל) ויונומיצין (1 מיקרוגרם/מ"ל) בנוכחות מעכב הובלת חלבונים (1 מיקרוליטר/מ"ל) למשך 4-6 שעות.
   1. קצרו את התאים והכתימו אותם בנוגדן נגד CD4 (מצומד PerCP, 0.2 מ"ג/מ"ל, דילול 1:100; או מצומד FITC, 0.5 מ"ג/מ"ל, דילול 1:100) למשך 30 דקות.
   2. תקן את התאים עם 200 μL של מאגר קיבוע למשך 20-60 דקות. לאחר הקיבוע, לשטוף את התאים 2x עם 1 מ"ל של חיץ permeabilization.
   3. ביצוע צביעה תוך תאית עם נוגדנים נגד GM-CSF (PE-מצומד, 0.2 מ"ג/מ"ל, דילול 1:100), IL-17A (FITC-מצומד, 0.5 מ"ג/מ"ל, דילול 1:100; APC-מצומד, 0.2 מ"ג/מ"ל, דילול 1:100), IL-4 (APC-מצומד, 0.2 מ"ג/מ"ל, דילול 1:100) ו-IFNγ (APC-מצומד, 0.2 מ"ג/מ"ל, דילול 1:100; PE-מצומד, 0.2 מ"ג/מ"ל, דילול 1:100) למשך 30 דקות בחושך.

טבלה 1: ציטוקינים ונוגדנים משומשים.

שם	ריכוז מלאי	ריכוז עבודה	דילול	נפח במאגר צביעה 500 μL
CD4-PerCp	0.2 מ"ג/מ"ל	2.8 מיקרוגרם/מ"ל	1:71	7 מיקרוליטר
CD44-APC	0.2 מ"ג/מ"ל	2.4 מיקרוגרם/מ"ל	1:83	6 μL
CD25-PE	0.2 מ"ג/מ"ל	2 מיקרוגרם/מ"ל	1:100	5 מיקרוליטר
CD62L-FITC	0.5 מ"ג/מ"ל	10 מיקרוגרם/מ"ל	1:50	10 מיקרוליטר
GM-CSF-PE	0.2 מ"ג/מ"ל	2 מיקרוגרם/מ"ל	1:100
IL-17A-FITC	0.5 מ"ג/מ"ל	5 מיקרוגרם/מ"ל	1:100
IL-17A-APC	0.2 מ"ג/מ"ל	2 מיקרוגרם/מ"ל	1:100
IFNγ-APC	0.2 מ"ג/מ"ל	2 מיקרוגרם/מ"ל	1:100
IFNγ-PE	0.2 מ"ג/מ"ל	2 מיקרוגרם/מ"ל	1:100
IL-4-APC	0.2 מ"ג/מ"ל	2 מיקרוגרם/מ"ל	1:100
CD4-FITC	0.5 מ"ג/מ"ל	5 מיקרוגרם/מ"ל	1:100
IL-7	20 מיקרוגרם/מ"ל	2 נ"ג/מ"ל	1:10000
אנטי-CD28	0.5 מ"ג/מ"ל	1 מיקרוגרם/מ"ל	1:500
אנטי-IFNγ	1 מ"ג/מ"ל	10 מיקרוגרם/מ"ל	1:100

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
RPMI 1640	ביוווסט	L0500-500
FBS מנוטרל בחום	גדי	FBS-HI-12A
פניצילין-סטרפטומיצין	גיבקו	15140122
10x PBS	בסיס ראשון	BUF-2040-10	מדולל ל-1x PBS במים סטריליים
EDTA	בסיס ראשון	BUF-1053-100ml-pH8.0
מאגר ACK 10X	ביואגדה	420301	מדולל במים סטריליים
מסננת תאים	SPL מדעי החיים	93070
מיקרו-כדוריות CD4	Miltenyi ביוטק	130-049-201
2-מרקפטואתנול	סיגמא	M7522
עמודת LS	Miltenyi ביוטק	130-042-401
מעמד מגנטי	Miltenyi ביוטק	130-042-303
1 מ"ל מזרק	תרומו	SS+01T
צנטריפוגה	אפנדורף	אפנדורף 5810R
Sony SY3200 סדרן תאים	סוני	Sony SY3200 סדרן תאים
50 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטי	גריינר ביו-וואן	210261
צינור צנטריפוגה חרוטי באורך 15 מטר	גריינר ביו-וואן	188271
שפופרת FACS	קורנינג	352054
נגד עכבר CD4 PerCP-eFluor 710	eBioscience	46-0041-82
PE-מצומד נגד עכבר CD25 (IL-2Ra, p55)	eBioscience	12-0251-82
נגמ"ש CD44 נגד אדם/עכבר	eBioscience	17-0441-82
CD62L FITC נגד עכבר	eBioscience	11-0621-85
תא ספירה משופר של נויבאואר	מרינפלד	640010
Hyclone Trypan Blue פתרון	GE בריאות מדעי החיים	SV30084.01
מיקרוסקופ	ניקון	Nikon Elipse TS100
נוגדן CD3e מטוהר נגד עכבר	ביואגדה	100314
אוגר מטוהר נגד עכבר CD28	BD Biosciences	553295
חולדה מטוהרת נגד עכבר IFNγ	eBioscience	16-7312-85
נוגדן מטוהר נגד עכבר IL-4	ביואגדה	504102
חלבון עכבר רקומביננטי IL-7	מערכת מו"פ	407 מ"ל
PMA	מרק מיליפור	19-144
יונומיצין	סיגמא	I0634
מעכב הובלת חלבונים GolgiPlug	BD Biosciences	51-2301KZ
ערכת חיץ קיבוע וחדירה תוך-תאית	eBioscience	88-8824-00
GM-CSF PE נגד עכבר	eBioscience	12-7331-82
FITC נגד עכבר IL-17A	ביואגדה	506908
APC נגד עכבר IFN-גמא	ביואגדה	505810