בידוד מגנטי של תאי מיקרוגליה ממוחות של גורי עכברים

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. דיסוציאציה מוחית ובידוד מיקרוגליאה מגנטי

הערה: יש לבצע בזהירות רבה את כל המניפולציות והמתלים של התאים עם פיפטה של 1,000 מיקרוליטר. יישום פעולה מכנית גבוהה עשוי להפעיל או להרוג תאי מיקרוגליה.

1. העברה של 12 חתיכות מוח (~1.2 גרם) לכל צינור דיסוציאציה המכיל תערובת דיסוציאציה לפי טבלה 1. עבור 24 גורים יהיה צורך בארבע צינוריות C (איור 1A-B).
2. מניחים C-Tubes על הדיסוציאטור (עם מצב חימום). הפעל את תוכנית NTDK הממוטבת בציוד בהתאם להוראות היצרן (איור 1D).
3. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 20 שניות (ב 4 ° C) לאסוף את כל התאים. השלימו את הדיסוציאציה המכנית על-ידי פיפטציה שלוש פעמים למעלה ולמטה עם פיפטה של 1,000 מיקרוליטר (איור 1E).
4. מעבירים את התאים לארבעה צינורות 15 מ"ל + מסננות. שטפו את המסננות עם 10 מ"ל של 1x תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺ (HBSS+/+) (איור 1F).
5. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 ° C) ולהסיר את supernatant. השהה בזהירות את הגלולה עם 10 מ"ל של HBSS+/+ (איור 1G).
6. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 ° C) ולהסיר את supernatant. השהה בזהירות את הגלולה עם 6 מ"ל של חיץ מיון (1x PBS + 0.5% BSA) (איור 1H).
7. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 ° C) ולהסיר את supernatant. הוסף 200 μL של תמיסת CD11b-microbead לכל צינור והשהה מחדש בזהירות (איור 1I).
8. דגרו על הצינורות במשך 15-20 דקות בטמפרטורה של 4°C. השהו בזהירות את הגלולה עם 6 מ"ל של חיץ מיון (איור 1I-J).
9. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 ° C) ולהסיר את supernatant. השהה בזהירות את הגלולה עם 8 מ"ל של חיץ מיון (איור 1K).
10. עקוב אחר תוכנית POSSEL במפריד (ראה טבלת חומרים) כדי להכין שמונה עמודות. העברת תאים 1 מ"ל על 1 מ"ל בעמודה. המתן עד שכל התאים יעברו לפני הוספת מ"ל נוסף. Elute CD11b+ תאים על צלחת אלוציה סטרילית עם 1 מ"ל של חיץ מיון (איור 1L).
11. בריכת תאי CD11b+ בצינור חדש של 50 מ"ל (איור 1M).
12. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 ° C) ולהסיר את supernatant. השהה בזהירות את הגלולה עם 10 מ"ל של מדיום מיקרוגליה קר (מדיום תרבית ללא סרום מקרופאגים (SFM) + 1% של פניצילין-סטרפטומיצין (P/S)) (איור 1N).
13. ספור את תאי CD11b+ . ב-P8 יש להשיג ~650,000 תאים לכל מוח.
    הערה: בפרוטוקול הנוכחי, התאים נספרו באמצעות מונה תאים אוטומטי (ראה טבלת חומרים).
14. להשהות מחדש את התאים בתווך מיקרוגליה קר לריכוז סופי של 650,000-700,000 תאים/מ"ל ולחלק בצלחות תרבית תאים.
    הערה: לוחות 6 בארות הם עבור כתם מערבי (2 מ"ל לכל באר); לוחות 12 בארות הם עבור ניתוח RT-qPCR (1 מ"ל לכל באר), ואת לוחות 96 באר הם עבור בדיקה phagocytic (250 μL לכל באר).

טבלה 1: הכנת תערובת הדיסוציאציה.

איור 1: ייצוג סכמטי של דיסוציאציות מוחיות ובידוד תאי מיקרוגליה. (א-ג) לאחר דיסקציה מוחית של עכבר P8 והסרת נורות אולפאקטיביות והמוח הקטן, המוח הועבר תחילה לצלוחית פטרי עם HBSS+/+, ולאחר מכן לצינורות דיסוציאציה המכילים את תערובת הדיסוציאציה. צינורות C הונחו על הדיסוציאטור (עם מצב החימום), ותוכנית NTDK הופעלה (D). (ה) בסוף התוכנית צוננו צינורות במהירות של 300 x גרם למשך 20 שניות ב-4 מעלות צלזיוס; הדיסוציאציה הושלמה על ידי פיפטציה שלוש פעמים למעלה ולמטה עם פיפטה של 1,000 מיקרוליטר. (F) התאים הועברו לאחר מכן לצינורות של 15 מ"ל + מסננות של 70 מיקרומטר ונשטפו ב-10 מ"ל של HBSS+/+. (G) לאחר מכן הדגימות צוננו במהירות של 300 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, הסופרנאטנט הוסר, והגלולה הושעתה מחדש עם 10 מ"ל של HBSS+/+. (H) צינורות היו שוב צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C; הסופרנאטנט הוסר, ואז הגלולה הושעתה מחדש ב 6 מ"ל של חיץ מיון. (I) צינורות היו צנטריפוגות ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C, supernatant הוסר, ואת הפתרון CD11b-microbead (200 μL) הוסיף. צינורות הודגרו במשך 15-20 דקות ב 4 ° C, ולאחר מכן הושעה מחדש ב 6 מ"ל של חיץ מיון (J) וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. (K) supernatant הוסר, ואת הגלולה היה תלוי בזהירות 8 מ"ל של חיץ מיון. (L) לאחר מכן, הפעל את תוכנית POSSEL על המפריד כדי להכין עמודות. תאים הועברו 1 מ"ל על 1 מ"ל על העמודה, ותאי CD11b נמהלו על צלחת אלוציה סטרילית עם 1 מ"ל של חיץ מיון. (M) תאי CD11b אוגמו בצינור חדש של 50 מ"ל וצנטריפוגות ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב -4 מעלות צלזיוס, והסופרנאטנט הוסר. (N) הגלולה הושעתה בזהירות ב-10 מ"ל של מדיום מיקרוגליה קר בשלב האחרון. התאים נספרו ונמהלו בתווך המיקרוגליאה עד לריכוז סופי של 650,000-700,000 תאים/מ"ל שחולקו בלוחות תרבית תאים.