בידוד מגנטי של תאי מיקרוגליה ממוחות של גורי עכברים

תקציר

מקור: Bokobza, C. et al., בידוד מגנטי של תאי מיקרוגליאה מעכבר יילוד עבור תרביות תאים ראשוניות. J. Vis. Exp. (2022)

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי CD11b, כולל מיקרוגליה, ממוחות של גורי עכברים באמצעות מיון תאים המופעל באמצעות מגנטית. רקמות המוח הומוגניות כדי לקבל תרחיפים חד-תאיים, אשר מודגרים עם מיקרו-חרוזים מצופים נוגדנים נגד CD11b, ולאחר מכן הפרדה מבוססת עמודה מגנטית כדי לטהר את אוכלוסיית התאים CD11b+.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. דיסוציאציה מוחית ובידוד מיקרוגליאה מגנטי

הערה: יש לבצע בזהירות רבה את כל המניפולציות והמתלים של התאים עם פיפטה של 1,000 מיקרוליטר. יישום פעולה מכנית גבוהה עשוי להפעיל או להרוג תאי מיקרוגליה.

1. העברה של 12 חתיכות מוח (~1.2 גרם) לכל צינור דיסוציאציה המכיל תערובת דיסוציאציה לפי טבלה 1. עבור 24 גורים יהיה צורך בארבע צינוריות C (איור 1A-B).
2. מניחים C-Tubes על הדיסוציאטור (עם מצב חימום). הפעל את תוכנית NTDK הממוטבת בציוד בהתאם להוראות היצרן (איור 1D).
3. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 20 שניות (ב 4 ° C) לאסוף את כל התאים. השלימו את הדיסוציאציה המכנית על-ידי פיפטציה שלוש פעמים למעלה ולמטה עם פיפטה של 1,000 מיקרוליטר (איור 1E).
4. מעבירים את התאים לארבעה צינורות 15 מ"ל + מסננות. שטפו את המסננות עם 10 מ"ל של 1x תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺ (HBSS+/+) (איור 1F).
5. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 ° C) ולהסיר את supernatant. השהה בזהירות את הגלולה עם 10 מ"ל של HBSS+/+ (איור 1G).
6. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 ° C) ולהסיר את supernatant. השהה בזהירות את הגלולה עם 6 מ"ל של חיץ מיון (1x PBS + 0.5% BSA) (איור 1H).
7. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 ° C) ולהסיר את supernatant. הוסף 200 μL של תמיסת CD11b-microbead לכל צינור והשהה מחדש בזהירות (איור 1I).
8. דגרו על הצינורות במשך 15-20 דקות בטמפרטורה של 4°C. השהו בזהירות את הגלולה עם 6 מ"ל של חיץ מיון (איור 1I-J).
9. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 ° C) ולהסיר את supernatant. השהה בזהירות את הגלולה עם 8 מ"ל של חיץ מיון (איור 1K).
10. עקוב אחר תוכנית POSSEL במפריד (ראה טבלת חומרים) כדי להכין שמונה עמודות. העברת תאים 1 מ"ל על 1 מ"ל בעמודה. המתן עד שכל התאים יעברו לפני הוספת מ"ל נוסף. Elute CD11b+ תאים על צלחת אלוציה סטרילית עם 1 מ"ל של חיץ מיון (איור 1L).
11. בריכת תאי CD11b+ בצינור חדש של 50 מ"ל (איור 1M).
12. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 ° C) ולהסיר את supernatant. השהה בזהירות את הגלולה עם 10 מ"ל של מדיום מיקרוגליה קר (מדיום תרבית ללא סרום מקרופאגים (SFM) + 1% של פניצילין-סטרפטומיצין (P/S)) (איור 1N).
13. ספור את תאי CD11b+ . ב-P8 יש להשיג ~650,000 תאים לכל מוח.
    הערה: בפרוטוקול הנוכחי, התאים נספרו באמצעות מונה תאים אוטומטי (ראה טבלת חומרים).
14. להשהות מחדש את התאים בתווך מיקרוגליה קר לריכוז סופי של 650,000-700,000 תאים/מ"ל ולחלק בצלחות תרבית תאים.
    הערה: לוחות 6 בארות הם עבור כתם מערבי (2 מ"ל לכל באר); לוחות 12 בארות הם עבור ניתוח RT-qPCR (1 מ"ל לכל באר), ואת לוחות 96 באר הם עבור בדיקה phagocytic (250 μL לכל באר).

טבלה 1: הכנת תערובת הדיסוציאציה.

תמיסה	עבור צינור C אחד (μL)	עבור ארבע שפופרות C (μL)
מאגר X	2850	11400
אנזים P (פפאין)	75	300
אנזים A (DNAse)	15	60
חיץ Y	30	120
סך	2970	11880

תוצאות

איור 1: ייצוג סכמטי של דיסוציאציות מוחיות ובידוד תאי מיקרוגליה. (א-ג) לאחר דיסקציה מוחית של עכבר P8 והסרת נורות אולפאקטיביות והמוח הקטן, המוח הועבר תחילה לצלוחית פטרי עם HBSS+/+, ולאחר מכן לצינורות דיסוציאציה המכילים את תערובת הדיסוציאציה. צינורות C הונחו על הדיסוציאטור (עם מצב החימום), ותוכנית NTDK הופעלה (D). (ה) בסוף התוכנית צוננו צינורות במהירות של 300 x גרם למשך 20 שני...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אלבומין בסרום בקר	Miltenyi ביוטק	130-091-376
CD11b (מיקרוגליה) MicroBeads, h, m	Miltenyi ביוטק	130-093-634
D-PBS (פי 10)	תרמו סיינטיפיק	14200067
תרבית תאי בז צלחת 12 בארות, תחתית שטוחה + מכסה	דוטשר	353043
צינורות בז 50 מ"ל	צינורות בז 50 מ"ל	352098
ערכה לדיסוציאציה של רקמות עצביות - פפאין	Miltenyi ביוטק	130-092-628
Nucleocounter NC-200	כימומטק
Nun EZFlip Top צינורות צנטריפוגות חרוטיות	תרמו סיינטיפיק	362694
צלחת פטרי אופטילוקס - 100 x 20 מ"מ	דוטשר	353003
צינורות gentleMACS C (4 x 25 צינורות)	Miltenyi ביוטק	130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator עם תנורי חימום	Miltenyi ביוטק	130-096-427
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x	תרמו סיינטיפיק	14065049
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)	תרמו סיינטיפיק	15140122
מדיום ללא מקרופאגים-SFM בסרום	תרמו סיינטיפיק	12065074
פתרון מניות MACS BSA	Miltenyi ביוטק	130-091-376
MACS SmartStrainers (70 מיקרומטר), 4 x 25 יח '	Miltenyi ביוטק	130-110-916
מפריד MultiMACS Cell24	Miltenyi ביוטק
בלוקים מרובי 24 עמודות	Miltenyi ביוטק	130-095-691