טכניקת גבאג' תוך קיבתי לזיהום הליקובקטר מבוקר בעכברים

תקציר

מקור: D'Costa, K. et al., Mouse מודלים של זיהום הליקובקטר ופתולוגיות קיבה.J. Vis. Exp.(2018)

סרטון זה מדגים את ביסוס זיהום הליקובקטר פילורי באמצעות טכניקת gavage תוך קיבתי במודל עכבר. התרחיף החיידקי מנוהל באמצעות קטטר המוחדר דרך הפה לתוך הקיבה. חיידקים מחוסנים מתיישבים ויוצרים זיהום בקיבה, אשר ניתן להשתמש בו כדי לחקור את האינטראקציה בין המארח לפתוגן.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. גידול והכנה של אינוקולה חיידקית

1. הפשרת מלאי גליצרול של הליקובקטר פילורי (H. pylori) או H. felis מ -80 ° C ותת-תרבית על צלחות אגר דם סוס (HBA) הכוללות: בסיס אגר דם מס '2 (ראה טבלת חומרים); שונה "תוסף סלקטיבי אנטיביוטי של Skirrow" (המורכב vancomycin, 10 מיקרוגרם / מ"ל; polymyxin B, 25 ננוגרם/מ"ל; trimethoprim, 5 מיקרוגרם / מ"ל; אמפוטריצין B, 2.5 מיקרוגרם/מ"ל); ו-5-10% (v/v) דם סוס. החיידקים גדלים היטב בתנאים מיקרו-אירוביים בצנצנות אנאירוביות של 2.5 או 3.5 ליטר המכילות את חבילות הגזים המתאימות (ראו טבלת חומרים), בטמפרטורה של 37°C.
   הערה: זני H. pylori הגדלים בתנאים אלה חייבים להיות בתת-תרבית לאחר 1-1.5 ימים של דגירה, בעוד שעבור H. felis, נדרשים בדרך כלל לפחות יומיים של דגירה. אמצעי תרבות ואחסון מתאימים תוארו בפירוט בעבר.
2. הכינו אינוקולה חיידקית להדבקת עכברים מתרביות שלב לוגריתמי מוקדם עד בינוני. קצרו חיידקים בעדינות מצלחות אגר על ידי הצפת כל צלחת ב-1-2 מ"ל של מרק עירוי לב מוחי (BHI). שאפו מתלים מצלחות עם פיפטות פסטר.
   1. לחלופין, הכינו אינוקולה מחיידקי הליקובקטר שהופצו בציר BHI במשך 16-18 שעות. במקרה זה, לאסוף חיידקים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ב 2,200 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
3. להעריך את הכדאיות והתנועתיות של החיידקים על ידי בחינת תכשירי הרכבה רטובים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (יעד 100X). הכינו תושבות רטובות על ידי השעיה מחדש של לולאה של חיידקים בטיפה של 10-20 μL של ציר BHI על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית. במקרה של H. felis, שהוא חיידק גדול בהרבה מהליקובקטר פילורי, השתמשו בהמוציטומטר כדי לספור במדויק את מספר החיידקים הקיימים. יש לאשר את טוהר התרבית על ידי ביצוע כתם גרם.
   הערה: השתמש ב- H. pylori inocula רק אם לרוב החיידקים יש צורה חיידקית או ספירלית (המורפולוגיה יכולה להשתנות בהתאם לזן). H. felis inocula צריך להכיל בעיקר חיידקים בצורת סליל.אין להשתמש באינוקולה אם לרוב החיידקים יש מורפולוגיה קוקואידית, מכיוון שצורות אלה אינן בנות קיימא ולא יבססו זיהום בעכברים.
4. להעריך את מספר החיידקים בחיסון על ידי ספירה תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה את מספר החיידקים המשוער לשדה (100X מטרה) ועל ידי שימוש במדריך הבא: חיידק אחד לשדה = כ -10⁶ יחידות יוצרות מושבה (CFU) של הליקובקטר / מ"ל; 10 חיידקים לשדה = כ 10⁷ CFU/מ"ל; 100 חיידקים לשדה = כ 10⁸ CFU/מ"ל, וכו.
   1. בעת שימוש בהמוציטומטר, חשב CFU/mL באמצעות הנוסחה הבאה:
      CFU/mL = (מספר ממוצע של חיידקים בשדה 4 x 4) x (גורם דילול) x (10,⁴).
5. התאימו את צפיפות תאי החיידקים של החיסון לכ-10^{7-10 8} CFU / מ"ל על ידי דילול בציר BHI, במידת הצורך.
   1. כדי להבטיח כדאיות חיידקית מקסימלית, להשתמש inocula עבור gavage intragastric בהקדם האפשרי לאחר ההכנה.
   2. תמיד לאשר את צפיפות התאים H. pylori ואת הכדאיות על ידי ביצוע ספירה קיימא של inocula מיד לאחר הליך gavage (ראה להלן). זה לא תמיד אפשרי עבור H. felis, כפי שהוא בדרך כלל לא ליצור מושבות מבודדות על מדיה תרבותית. לא ניתן לקבוע את מספר הליקובקטרs באינקולה על ידי מדידת צפיפות אופטית (A₆₀₀) בלבד, מכיוון ששיטה זו אינה מבחינה בין חיידקים בני קיימא (כלומר, חיידקים/ספירליים/הליקליים) לבין חיידקים שאינם בני קיימא (כלומר, קוקואיד).
   3. השתמש בערכי צפיפות אופטיים כאמצעי להערכת מספרם של חיידקי H. pylori קיימא באינוקולה, אך במקרה זה, תחילה יש צורך ליצור עקומת גדילה. לשם כך, ערכי A₆₀₀ של תרביות H. pylori מנוטרים לאורך זמן ומתואמים ישירות מול מספר החיידקים החיים, הנקבעים על ידי ספירת צלחות.
      הערה: שיטה נוחה לביצוע קביעות עקומת גדילה כאלה היא תרבית חיידקים בתווך נוזלי (סעיף 1.2), באמצעות צלוחיות סטנדרטיות של תרבית רקמה תחתונה שטוחה הממוקמות באינקובטור_CO2 של 10%. מספרי CFUs, שנקבעו על ידי aliquots של תרבויות שהתקבלו כל 4-6 שעות במשך 2-3 ימים, מושווים לאחר מכן לערכים המתאימים A₆₀₀. חשוב לציין, יש ליצור עקומות גדילה עבור כל זן H. pylori, שכן אלה עשויים לגדול בקצב שונה, יתר על כן, לא כל הזנים גדלים היטב ב -10% CO₂.

2. גבאג' תוך קיבתי של עכברים עם הליקובקטר

הערה: שיטה זו של gavage intragastric יכולה להיות מיושמת על מיני חיידקים אחרים המאכלסים את המעיים, למשל S. Typhimurium, C. rodentium, Listeria monocytogenes.

1. יש להשתמש בעכברים זכרים או נקבות בני 6-8 שבועות, ללא פתוגן ספציפי (SPF) וללא הליקובקטר. השתמש בבעלי חיים עם רקע גנטי C57BL/6 לניסויי זיהום עם H. pylori או H. felis. במחקר הנוכחי השתמשנו בעכברי פרא (WT) ובעכברי C57BL/6 מהונדסים גנטית ללא קולטן חיסוני מולד מרכזי (המכונה חיות נוק-אאוט או KO).
   הערה: עכברים בעלי רקע גנטי אחר יכולים לשמש גם לזיהומי הליקובקטר, אולם רמות הנשאות וחומרת המחלה עשויות להיות מושפעות מסוג הרקע המארח.
2. יש לשאוף את החיסון החיידקי (שלב 1.5) לתוך מזרקים חד פעמיים בנפח 1 מ"ל ולהחליף את המחטים המסופקות ב-23 מחטי מד שעליהן מוצמדים צנתרי פוליאתילן חד פעמיים (אורך, 6-8 ס"מ; קוטר פנימי, 0.58 מ"מ). הדקו את הצנתרים למחטים על ידי יישום רצועות קטנות של סרט פלסטיק (ראו טבלת חומרים). לחלופין, החלף את מכלול המחט/צנתר באמצעות צינורות הזנה סטריליים מפלסטיק (20 מד x 38 מ"מ).
3. ריסון פיזי של עכברים עם אחיזה איתנה בקשקוש הצוואר והזנב.
   הערה: הליך זה יכול להתבצע ללא הרדמה, או לחילופין, באמצעות חומר הרדמה בשאיפה, כגון מתוקסיפלורן או איזופלורן.
4. הכניסו את הצנתר למרכז הלסת הפתוחה וכיוונו אותו לכיוון הוושט. האריכו את צוואר העכבר כדי לאפשר גישה נוחה לקיבה דרך הוושט (והרחק מקנה הנשימה) עד שרוב הצנתר או כולו כבר לא נראה לעין ומורגשת התנגדות, המתאימה לבסיס הקיבה. ספק aliquot ספציפי, בדרך כלל 100 μL לכל חיסון (איור 1).
   הערה: עכברים צריכים להיות gavaged עם ≥ 10⁵ CFU כדי להבטיח נשאות אופטימלית פתולוגיה המחלה.

תוצאות

איור 1: תמונה המדגימה את טכניקת ה-gavage האוראלי. מזרק חד פעמי של 1 מ"ל וקטטר גמיש משמשים להעברת ≥10⁵ CFU של אינוקולה חיידקית לעכבר דרך המסלול התוך קיבתי. העכבר הורדם באמצעות מתוקסיפלורן והוחזק באחיזה איתנה בצוואר, מה שאפשר גישה של הקטטר לקיבה דרך הוושט.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנטים בקטריולוגיים
בסיס אגר דם אוקסואידי מס '2	תרמו פישר סיינטיפיק	CM0271B	יש להמיס במים שעברו דה-אינוניזציה לפני העיקור
דם סוס פרימיום דפיברין	ביולוגים אתיים אוסטרליים	PDHB100
מרק עירוי לב Bacto למוח	BD Bioscience	237500	יש להמיס במים שעברו דה-אינוניזציה לפני העיקור
חבילות גז CampyGen	תרמו פישר סיינטיפיק	CN0035A/CN0025A
ריאגנטים אחרים
מתוקסיפלורן (Pentrhox)	פיתוחים רפואיים בינלאומיים	לא ישים
ציוד וכלי פלסטיק
צנצנות אנאירוביות אוקסואיד	תרמו פישר סיינטיפיק	HP0011/HP0031
פיפטות קופאן פסטר	שירותי Interpath	200CS01
צנטריפוגת אפנדורף 5810R			איסוף כדורי חיידקים באמצעות צנטריפוגה ב-2,200 סל"ד למשך 10 דקות ב-4°C
מחט גלישה מדויקת 23 גרם	BD Bioscience	301805
פארפילם מ	Bemis, VWR	PM996
צינורות פוליתן פורטקס דק נשא	סמיתס מדיקל	800/100/200
צנתרי הזנה מפלסטיק	מעבדות אינסטק	FTP20-30
1 מ"ל מזרקים חד פעמיים להחליק שחפת	BD Bioscience	302100
Eppendorf micropestle עבור 1.2 - 2 מ"ל צינורות	סיגמא אולדריץ'	Z317314	מזיקים פוליפרופילן autoclavable המשמשים הומוגניזציה בקיבה
לולאת פלסטיק סטרילית	LabServ	LBSLP7202