טכניקה לגילוי שחפת אקסטרה-פולמונרית באמצעות ננו-גשושיות על-פאראמגנטיות

תקציר

מקור: Lee, C., et al. סינתזה, אפיון ויישום של ננו-גשושיות תחמוצת ברזל על-פאראמגנטיות לגילוי שחפת חוץ-ריאתית. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים טכניקה לזיהוי שחפת חוץ-ריאתית. ננו-בדיקות של תחמוצת ברזל על-פאראמגנטית (SPIO), המצומדות לנוגדנים ספציפיים למיקובקטריום, מוזרקות לעכבר שהיה נגוע בעבר ב-Mycobacterium bovis BCG, מתייגות את הגרנולומה ומספקות ניגודיות הדמיה טובה יותר לזיהויה.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. סינתזת SPIO-MtbsAb

1. סנתז SPIO-conjugated 2,2'-(ethylenedioxy)bisethylamine (EDBE) באמצעות שיטות שדווחו בעבר.
2. לסנתז SPIO-EDBE-succinic anhydride (SA).
   1. יש לערבב תמיסת אלקליין (5 M NaOH; 10 מ"ל)) של SPIO-EDBE וחומצה סליצילית (1 גרם; 10 μmol) בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
   2. דיאליזה של התמיסה עם 20 החלפות של 2 ליטר מים מזוקקים באמצעות צינורות קרום נקבובי מולקולרי (חיתוך של 12,000-14,000 מגה-וואט). 6 שעות לכל שינוי.
3. לבסוף, הוסף 100 μL של SPIO-EDBE-SA (4 מ"ג / מ"ל של Fe) ל 400 μL של 4.5 מ"ג / מ"ל נוגדן פני השטח Mycobacterium tuberculosis (MtbsAb) כדי לסנתז SPIO-MtbsAb באמצעות 1-hydroxybenzotriazole ו (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate כמו זרזים ולערבב את התמיסה בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות.
4. לבסוף, להפריד את הפתרונות מן הנוגדן unbound באמצעות כרומטוגרפיה סינון ג'ל.
5. טען את תערובת התגובה (5 מ"ל) על עמוד בגודל 2.5 ס"מ × 33 ס"מ ונמחק באמצעות מאגר מלח חוצץ פוספט (PBS). אשר את קומפלקס Ab-nanoparticle (כלומר, nanoprobe) באמצעות ערכת בדיקת חלבון חומצה ביכונית.

2. תצפית מורפולוגיית חלקיקים ומדידת שכבת הרפיה

1. בחנו את גודל החלקיקים, המורפולוגיה והתפלגות הגודל הממוצעת באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת במתח של 100 קילו-וולט.
   1. הטילו את הפיזור המרוכב על רשת נחושת של 200 רשת וייבשו באוויר בטמפרטורת החדר לפני העמסתם על המיקרוסקופ.
2. מדוד את ערכי זמן ההרפיה (T1 ו- T2) של ננו-גשושיות באמצעות מד הרפיה NMR ב- 20 MHz ו- 37.0 ° C ±- 0.1 ° C.
   1. כייל את מד הרפיה לפני כל מדידה.
   2. רשום את ערכי r1 ו- r2 משמונה נקודות הנתונים שנוצרו באמצעות שחזור היפוך ורצף הדופק Carr-Purcell-Meiboom-Gill, בהתאמה, כדי לקבוע את הרגיעה r1 ו- r2.

3. דימות תאי

1. טפח מונוציטים אנושיים THP-1 בסל"ד 1640 עם 10% נסיוב בקר עוברי, 50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין סולפט, 100 יחידות/מ"ל פניצילין G נתרן, 100 מיקרוגרם סטרפטומיצין סולפט ו-0.25 מיקרוגרם/מ"ל פטרייה באינקובטור 5% CO₂ ב-37°C.
2. לדגור על ננו-גשושיות SPIO-MtbsAb (2 מילימול) עם 106 יחידות יוצרות מושבה (CFU) של Mycobacterium bovis BCG מודגרות מראש עם 1 × 10⁷ מונוציטים פעילים בצינורות מיקרוצנטריפוגות (1 מ"ל) באינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C למשך 1 שעות.
3. צינורות צנטריפוגות ב 200 x גרם ומשליכים את supernatant. להמיס מחדש כדורים בתווך (200 μL).
4. סרוק את הדגימות באמצעות רצף פולס הד הדרגתי מהיר (זמן חזרה (TR) = 500; זמן הד (TE) = 20; זווית היפוך = 10°) עד MRI 3.0-T כדי לקבוע את הספציפיות והרגישות של הננו-גשוש.

4. חיסון BCG (Bacillus Calmette–Guérin)

1. הרכיבו מחדש את החיסון הליופילי או את מלאי החיידקים בתווך של סאוטון ולאחר מכן דללו את המלאי במי מלח עד לפיזור תקין כפי שתואר קודם לכן.
2. חיסון זן חי מוחלש של M. bovis BCG, המתקבל מ-ADIMMUNE (טאיפיי, טייוואן) (זן Connaught; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) בנפח של 0.1 מ"ל/עכבר (כלומר, 10⁷ CFU) תוך עורית לתוך העור הגבי השמאלי או הימני של עכברים, כפי שתואר קודם לכן. הזריקו מי מלח לעכברים כביקורת שלילית. יש לעקוב אחר בעלי חיים מדי יום לאחר חיסון BCG.
3. להקריב בעלי חיים חודש לאחר חיסון חיידקים באמצעות המתת חסד פחמן דו חמצני. קצרו את הרקמה מאתר החיסון התוך-עורי. מקבעים את הרקמה ב-10% פורמלין ומטמיעים אותה בפרפין למקטעים טוריים ב-5-10 מיקרומטר. מכתימי רקמה עם כתמי המטוקסילין/אאוזין וזיהל-נילסן עבור חיידקים מהירים חומציים ועם כחול ברלין עבור ברזל ברזל.

5. MRI In vivo

1. הזריקו קטמין (80 מ"ג/ק"ג משקל גוף) וקסילזין (12 מ"ג/ק"ג משקל גוף) לעכברים להרדמה של בעלי חיים.
2. הזריקו בדיקות SPIO-TbsAb (2 nmol/200 μL) לתוך ורידי הזנב של עכברים. עכברי תמונת MR לפני ומיד לאחר הזרקת בדיקה ולאחר מכן כל 5 דקות במשך 30 דקות כדי לקבל תמונות ספין הד מהיר משוקלל T2 (TR = 3000; TE = 90; שדה ראייה = 8).
3. נתח כמותית את כל תמונות ה- MR באמצעות עוצמת אות (SI), מדידה של אזורי עניין מוגדרים במיקומים דומים של מרכז גרנולומה Mtb ושריר הגב הסמוך לאזור גרנולומטי.
4. חשב שיפורי אות יחסיים באמצעות מדידת SI לפני (SIpre; בקרה) ו- 0-3 שעות לאחר הזרקת חומרי הניגוד (SIpost) באמצעות הנוסחה
   [(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100
   כאשר SIpre הוא SI של הנגע בסריקה המשופרת מראש ו- SIpost הוא SI של הנגע בסריקה שלאחר השיפור.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
(בנזוטריאזול-1-אילוקסי) טריפירולידינופוספוניום הקספלואורופוספט	סיגמא-אולדריץ'
1-הידרוקסיבנזוטריאזול	סיגמא-אולדריץ'
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(אתילאמין)	סיגמא-אולדריץ'
מונוציטים אנושיים THP-1
מ. בוביס BCG	פסטר מריה	זן קונאט; ImmuCyst אוונטיס
MRI	GE מערכות רפואיות	3.0-T, סיניה
מד ריליקום NMR	ברוקר	NMS-120 Minispec
צינורות קרום נקבובי מולקולרי ספקטרום, 12,000 -14,000 MW מנותקים	ספקטרום מעבדות בע"מ
נוגדן משטח שחפת- נוגדן רב-שבטי ל-Mtb	Acris נוגדנים GmbH	BP2027
מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת	ג'אול	JEM-2000 EX II