ייצור נוגדנים מתרבית גידול יתר של תאי יונקים נגועים

תקציר

מקור: Elgundi, Z. et al., ייצור בקנה מידה מעבדתי וטיהור של נוגדן טיפולי.J. Vis. Exp.(2017)

הסרטון מדגים שיטה לייצור נוגדנים טיפוליים באמצעות תאי יונקים נגועים ביציבות. תוספת טריפטון ממריצה את חלוקת התא, וכתוצאה מכך צמיחת יתר ותמיכה בתפוקת נוגדנים גבוהה יותר. המדיום המכיל נוגדנים נקצר, מסונן ומאוחסן לשימוש נוסף.

פרוטוקול

NOTE: יש להשתמש בווקטור ביטוי יונקים מתאים לפרוטוקול זה. כאן נעשה שימוש במבנה יחיד המכיל שתי קלטות ביטוי (כלומר, ביטוי שרשרת כבד וקל מונע על ידי מקדמים נפרדים). שרשראות כבדות וקלות של טרסטוזומאב שובטו בעבר לתוך הווקטור. וקטור זה היה מתנה מאנדרו בוויל, שהושג באמצעות מאגר פלסמיד ללא מטרות רווח.

1. שחזור והרחבה של DNA וקטורי

הערה: DNA וקטורי התקבל כתרבית דקירה אגר רכה בזן Escherichia coli XL-1 Blue; וקטור נושא עמידות להיגרומיצין.

1. הכניסו דקירה או לולאה סטרילית לאגר הרך של תרבית הדקירה, ואז פזרו צלחת אגר לוריא ברטאני (LB) שהוכנה עם היגרומיצין 75 מיקרוגרם/מ"ל למושבות מבודדות. לדגור על הצלחת ב 37 ° C במשך 18-24 שעות.
2. לחסן מושבה אחת לתוך 5 מ"ל מרק נהדר (שחפת) המכיל 75 מיקרוגרם / מ"ל היגרומיצין. לדגור על התרבית ב 37 ° C במשך 18-24 שעות עם רעד ב 225 סל"ד.
3. השתמש בתרבית לילה כדי להכין מלאי גליצרול של DNA וקטורי על ידי ערבוב עדין של 800 μl של תרבית עם 200 μl 80% גליצרול ב cryovial ולהקפיא ב -80 ° C.
   1. הוסיפו 100 מיקרוליטר של תרבית לילה ל-100 מ"ל שחפת המכילה 75 מיקרוגרם/מ"ל היגרומיצין בבקבוק שייקר מבולבל (כלומר, דילול של 1/1,000). לדגור על התרבית ב 37 ° C במשך 18-24 שעות עם 225 סל"ד רועד.
4. לאחר תרבית לילה, לחלץ ולטהר את חומצת הגרעין deoxyribose (DNA) על פי הוראות היצרן עבור ערכת הכנת midi/maxi עם החריג הבא; במהלך השלב האחרון, לנטרל או להשהות מחדש DNA עם מים (pH 7.0-8.5).
5. בדוק את הריכוז והטוהר של DNA על ידי קריאות ספיגה ב 260 ו 280 ננומטר, ולאחר מכן לאחסן DNA ב -20 ° C.
   הערה: אופציונלי (מומלץ מאוד): רצף DNA באמצעות פריימרים ספציפיים לווקטורים כדי לאשר זהות.

2. טרנספקציה יציבה של תאי HEK-293

1. לגדל ולתחזק תאי HEK-293 (תאי תרחיף) בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים במדיה נטולת סרום בתוספת 0.1% פעילי שטח לא יוניים בצלוחיות Erlenmeyer. לשמור על 2 x 10⁵ תאים/מ"ל ותת-תרבית כל יום רביעי. תאי תרבית בטמפרטורה של 37°C עם 5% פחמן דו-חמצני (CO₂) וסיבוב של 120 סל"ד.
   הערה: התאים היו צריכים להיות בתרבית לא פחות מ-4 ימים ולא יותר מ-4 שבועות לפני הטרנספקציה. תאי HEK-293 הגדלים כחד-שכבות במדיה המכילה סרום יכולים לשמש גם להליך זה.
2. ביום שלפני ההדבקה, זרע תאי HEK-293 ב 3 x 10⁵ תאים / מ"ל בבארות של צלחת 12 בארות ב 2 מ"ל של Dulbecco Modified Eagle Media (DMEM) בתוספת 10% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS). ביום הטרנספקציה, לבדוק כי התאים הגיעו 80-90% מפגש
3. לדלל DNA ופוליאתילנימין (PEI) בנפרד במדיום transfection ולאחר מכן לערבב אותם יחד.
   1. לדלל 1.25 מיקרוגרם DNA וקטורי לכל באר (15 מיקרוגרם עבור 12 בארות) במדיה טרנספקציה של 300 μl. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
   2. לדלל 2.5 μl של 1 מ"ג/מ"ל תמיסת PEI (30 μl עבור 12 בארות, כלומר יחס של 1:2 בין DNA ל- PEI) במדיה טרנספקציה של 300 μl. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
   3. מוסיפים DNA מדולל ל-PEI מדולל, מערבבים בעדינות ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
4. הוסף 50 μl של תערובת DNA/PEI טיפה לכל באר של הצלחת. רוקנו את הצלחת בעדינות כדי לפזר את תערובת הטרנספקציה, ואז הניחו את הצלחת על 37°C, 5% CO₂ למשך 24 שעות.
5. מוסיפים 50 מיקרוגרם/מ"ל היגרומיצין B לבאר ומחזירים את הצלחת ל-37°C, 5% CO₂ למשך 10 ימים.
   הערה: עד היום ה-10, תאים לא נגועים ימותו ויתנתקו מפני השטח של הצלחת, בעוד שתאים שעברו טרנסבקציה יציבה יהיו בני קיימא ומחוברים לצלחת.
6. החלף את המדיה בבארות עם 1/4 נפח מדיה ללא סרום ו 3/4 נפח DMEM בתוספת 10% FBS (כלומר 0.5 מ"ל מדיה ללא סרום + 1.5 מ"ל DMEM = 7.5% ריכוז הסופי בסרום) ודגרה במשך 4 ימים.
7. החלף את המדיה בבארות עם 1/2 נפח מדיה ללא סרום ו 1/2 נפח DMEM בתוספת 10% FBS (כלומר 1 מ"ל מדיה ללא סרום + 1 מ"ל DMEM = 5% ריכוז הסופי בסרום) ודגרה במשך 4 ימים.
8. יש להחליף את המדיה בבארות במדיה נטולת סרום בנפח 3/4 ו-DMEM בנפח 1/4 בתוספת FBS של 10% (כלומר 1.5 מ"ל מדיה ללא סרום + 0.5 מ"ל DMEM = ריכוז סופי של 2.5% בסרום) ולדגור במשך 4 ימים.
9. יש להחליף את המדיה בבארות ב-2 מ"ל של חומר ללא סרום בתוספת 0.1% חומרים פעילי שטח לא יוניים (כלומר ריכוז סופי של 0% בסרום) ולדגור במשך 4 ימים.
   הערה: יש לשמור על לחץ סלקטיבי של 50 מיקרוגרם/מ"ל היגרומיצין B על התאים במהלך הסתגלות ללא סרום. תאים המותאמים למדיה נטולת סרום מתנתקים מפני השטח של בארות ועלולים להתקבץ בתרחיף. עיין בשלב 2.1 עבור תנאי תרבית עם תוספת של 50 מיקרוגרם / מ"ל היגרומיצין B.
10. בעזרת פיפטה, מערבבים בעדינות את תרביות התרחיף בצלחת בעלת 12 הקידוחים ובתאי הבריכה לצינור נפרד.
    1. באמצעות המוציטומטר, יש לספור תאים מאוגמים וזרעים במדיה נטולת סרום של 30 מ"ל בבקבוק Erlenmeyer בגודל 2 x 10⁵ תאים/מ"ל. תאי תרבית בטמפרטורה של 37°C עם סיבוב של 5% CO₂ ו-120 סל"ד. תת-תרבות והרחבה כל יום רביעי.
11. המשך להרחיב את גודל התרבית לצפיפות התאים הנדרשת כדי לקבל 10 בקבוקונים ב 1 x 10⁷ תאים / בקבוקון לשימור בהקפאה בחנקן נוזלי. יש להקפיא את התאים במדיה נטולת סרום המכילה 10% דימתיל-סולפוקסיד (DMSO).
    הערה: ניתן לקצור מדיה מותנית המכילה נוגדנים בכל תת-תרבית כדי לאשר את ייצור החלבון, או להשתמש בה כדי למטב את תנאי הטיהור. כדי לקצור מדיה מותנית ולתחזק תאים עבור תת-תרבית, צנטריפוגו את התרבית במהירות של 300 x גרם למשך 5 דקות, ולאחר מכן סננו ועיקרו סופרנאטנט דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. סופרנאטנט מסונן עשוי להישמר בטמפרטורה של 4°C למשך שבוע-שבועיים או -20°C לאחסון לטווח ארוך יותר.

3. ייצור נוגדנים בקנה מידה גדול מתרבית גידול אצווה

NOTE: ניתן לעקוב אחר ייצור נוגדנים משלב 2.11, שבו תאים קיימים מורחבים לצפיפות התאים הנדרשת בהתבסס על נפח תרבית גידול האצווה שיש להגדיר. אחרת, תאים שהופשרו מהקפאה מתחילים בשלב זה לאחר שהורחבו לצפיפות תאים ונפח מתאימים. ניתן להשתמש בתוספי תרבית שונים כדי לייעל את ייצור הנוגדנים; השימוש בטריפטון להגדלת תפוקת הנוגדנים מודגם בפרוטוקול זה.

1. תאי זרעים בגודל 2 x 10⁵ תאים/מ"ל במדיה נטולת סרום של 100 מ"ל בשתי צלוחיות Erlenmeyer (כדי להשוות תפוקות נוגדנים מתרביות ללא תוספת ותוספי תזונה). תרבית ב-37°C, 5% CO₂ ו-120 סל"ד.
2. לאחר 24 שעות, יש להוסיף טריפטון לריכוז סופי של 0.5% לתרבית עם תוספי תזונה. השוו את הנפח של תרבית ללא תוספת עם מדיה ללא סרום.
3. מהיום השמיני, בצע ספירת תאים של התרביות מדי יום באמצעות המוציטומטר כדי לפקח על כדאיות התא. קצרו את הסופרנאטנטים של התרבית ברגע שיכולת הקיום של התא היא פחות מ-80%.
   1. קצרו סופרנאטנט על ידי צנטריפוגה של התרביות במהירות של 3,000 x גרם למשך 15 דקות, ולאחר מכן סננו את הסופרנאטנט (המכיל נוגדן) דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. אחסנו את הסופרנאטנטים בטמפרטורה של 4°C (לטווח קצר) או הקפיאו בטמפרטורה של -20°C (לטווח ארוך).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סדרת וקטורים pFUSE	לא ישים	InvivoGen	גנים כבדים וקלים של נוגדנים המתבטאים בווקטורים נפרדים הדורשים טרנספקציה משותפת.
סדרה וקטורית mAbXpress	לא ישים	ACYTE ביוטק Pty בע מ	גנים כבדים וקלים של נוגדנים המתבטאים בווקטורים נפרדים הדורשים טרנספקציה משותפת. עיין ב: Jones, M. L. et al. שיטה לעיצוב מחדש מהיר ובלתי תלוי קשירה של נוגדנים חד-שבטיים רקומביננטיים. J שיטות אימונוליות. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
וקטור pVITRO1	לא ישים	לא ישים	גנים של נוגדנים כבדים וקלים מונעים כל אחד על ידי מקדם נפרד בווקטור יחיד. עיין ב: Dodev, T. S. et al. ארגז כלים לשיבוט וביטוי מהיר של נוגדנים רקומביננטיים. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
סדרת וקטורים GS	לא ישים	לונזה	וקטור רב-ציסטרוני עם גנים של נוגדנים כבדים וקלים המבוטאים יחד ומתורגמים כתעתיק יחיד.
סדרה וקטורית רב-ציסטרונית 1	לא ישים	לא ישים	וקטור רב-ציסטרוני עם גנים של נוגדנים כבדים וקלים המבוטאים יחד ומתורגמים כתעתיק יחיד. עיין ב: Li, J. et al. מחקר השוואתי של עיצובים וקטוריים שונים לביטוי יונקים של נוגדני IgG רקומביננטיים. J שיטות אימונוליות. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
סדרה וקטורית רב-ציסטרונית 2	לא ישים	לא ישים	וקטור רב-ציסטרוני עם גנים של נוגדנים כבדים וקלים המבוטאים יחד ומתורגמים כתעתיק יחיד. עיין ב: Ho, S. C. et al. וקטורים טריציסטרוניים בתיווך IRES לשיפור יצירת נוגדנים חד-שבטיים גבוהים המבטאים קווי תאי CHO. ג'יי ביוטכנול. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ	61883	אדג'ין	וקטור ביטוי יונקים המכיל גנים נוגדנים trastuzumab עם גן עמידות hygromycin; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ היה מתנה מאנדרו Beavil.
מהיר מדיה Hygro אגר	FAS-HG-S	ג'ומר חקר החיים	משמש להכנת מלח נמוך LB אגר המכיל 75 מיקרוגרם / מ"ל hygromycin.
מדיה מהירה Hygro TB	FAS-HG-L	ג'ומר חקר החיים	משמש להכנת מרק שחפת דל מלח המכיל 75 מיקרוגרם / מ"ל היגרומיצין.
גליצרול, BioXtra, ≥99%	G6279	סיגמא-אולדריץ'	הכינו עד 80% עם מים ואוטוקלאב. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
ערכת מקסי פלסמיד Jestar 2.0/LFU	G221020	אסטרל סיינטיפיק	ערכת הכנת פלסמיד מקסי; לנטרל או להשהות מחדש DNA במים (pH 7.0-8.5).
תאים בסגנון FreeStyle של 293-F	₪190-07	לייף טכנולוגיות	קו תאי HEK-293 מותאם לתרבית מתלים במדיה נטולת סרום.
סגנון חופשי 293 ביטוי בינוני	12338-018	לייף טכנולוגיות	מדיה נטולת סרום שפותחה במיוחד לשמירה על קו תאים 293-F וביטוי חלבון גבוה.
קוליפור P188	K4894	סיגמא-אולדריץ'	פעילי שטח לא יוניים; F-68 פלורוני; יש להכין עד 10% במים ולסנן-לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן ב-4oC.
DMEM, גלוקוז גבוה	11995-065	לייף טכנולוגיות
סרום בקר עוברי מומת בחום	10082-147	לייף טכנולוגיות
פוליאתילנימין, ליניארי, MW 25,000	23966	Polysciences, Inc.	יש להכין ל-1 מ"ג/מ"ל במים. יש לכוונן ל-pH 7.0 עם 1 M HCl (התמיסה הופכת ברורה) ולסנן-לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של -80oC עד לשימוש.
OptiPro SFM	12309-050	לייף טכנולוגיות	מדיה ללא סרום עם נוסחת Transfection
היגרומיצין B פתרון	ANT-HG-1	ג'ומר חקר החיים
דימתיל-סולפוקסיד (DMSO)	AJA2225	תרמו פישר סיינטיפיק
טריפטון (קזאין פפטון)	LP0042B	תרמו פישר סיינטיפיק	יש להכין עד 20% ב-PBS ולסנן-לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן ב-4oC.
מערכת BLItz	45-5000	fortéBIO	מכשיר המשמש למדידות אינטרפרומטריה של שכבה ביולוגית (BLI).