כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. אוסף כדורי צואה טריים
- הכינו מגבות נייר סטריליות, מלקחיים קהים ושפופרות חרוטיות בנפח 50 מ"ל.
- הניחו כמה מגבות נייר ומלקחיים בשקיות autoclave נפרדות ו autoclave אותם ב 180 ° C בחום יבש במשך 30 דקות. השתמשו גם בצינורות חרוטיים סטריליים. שקלו את הצינורות החרוטיים ורשמו את משקלם על הצינורות.
- הפעל את ארון הבטיחות הביולוגית בחדר החיות.
- קחו כלוב עכבר נקי ללא מצעים והניחו אותו בארון הבטיחות הביולוגית. הסירו את הכיסוי ואת מדף המזון והניחו אותם בתוך הארון.
- הניחו מגבות נייר סטריליות בתחתית הכלוב והניחו את מתלה המתכת בחזרה על גבי הכלוב.
- זהה תורמי צואה תואמי גיל והכנס את כלוב העכבר לארון הבטיחות הביולוגית. פתחו את הכלוב ותפסו בעדינות עכבר תורם (C57BL/6J) בזנבו והניחו אותו על מתלה המתכת מעל הכלוב הנקי.
- הניחו את מכסה הכלוב על גבי המתלה והמתינו עד שבעל החיים יעשה את צרכיו.
הערה: הנח כמה מלטות עכבר על ארון התקשורת בו-זמנית.
- לאסוף את כדורי צואה ולשים אותם סטרילי 50 מ"ל צינור חרוט. בריכה את הכדורים לפי מין. אין לערבב כדורי צואה שנאספו מזכרים ונקבות.
- משקל הצינור שוב לחשב את המשקל של כדורי צואה.
2. הכנת השעיית צואה
- הכינו תמיסה סטרילית (10% גליצרול במי מלח רגילים).
- הוסף 10 מ"ל של 10% גליצרול/מלח רגיל לצינור החרוטי עבור כל גרם של כדורי צואה.
הערה: הגדל את נפח התמיסה ל- 20 מ"ל במידת הצורך. מחקר זה השתמש 1 מ"ל של תמיסה עבור כל כדור (5-10 מ"ג) גם כן.
- הומוגניזציה של התערובת במהירות נמוכה עם הומוגנייזר benchtop או בלנדר בתוך מכסה אדים כדי להשעות מחדש את הצואה (3 X 30 שניות).
- מסננים את תרחיף הצואה דרך 2 שכבות של גזה כותנה סטרילית (10.2 ס"מ x 10.2 ס"מ). אחסנו את התסנין באופן זמני במקרר עד 6 שעות או ארזו אותו בבקבוקונים קריוגניים סטריליים ואחסנו אותו במקפיא בטמפרטורה של -80°C.
- נקה היטב את ההומוגנייזר או הבלנדר בעקבות הליך סטנדרטי.
3. ניהול תרחיף צואה על ידי gavage אוראלי
- הפשירו את תרחיף הצואה הקפוא על קרח אם משתמשים בדגימות קפואות. מערבבים את תרחיף הצואה המופשר על ידי מערבולת.
- העבר את תרחיף הצואה הטרי או מופשר למזרקים 1 מ"ל.
הערה: כל עכבר יקבל סך של 200 μL של תרחיף צואה, וכל עכבר IL-10-/- בקבוצת הביקורת יקבל 200 μL של 10% גליצרול/מלח רגיל.
- שקלו את העכברים ובחרו את גודל מחט הגבאג' הנכון ואת נפח המינון המקסימלי.
הערה: עבור עכברים עם משקל גוף בין 20-25 גרם, השתמש במחט gavage מעוקלת 20 G 3.81 ס"מ עם כדור 2.25 מ"מ. אנא עיינו gavageneedle.com לקבלת מידע נוסף.
- בדוק את מחט gavage על ידי מדידת אורך מקצה האף של העכבר לתהליך xiphoid (החלק התחתון של עצם החזה). מלאו את המזרק ב-10% גליצרול/מלח או תרחיף צואה והסירו בועות אוויר בתוך המזרק והמחט.
הערה: אם המחט ארוכה מהאורך, יש לשים סימן על מוט המחט/צינור בגובה האף. אין להעביר את המחט/צינורית דרך בעל החיים מעבר לנקודה זו כדי למנוע ניקוב קיבה.
- הכניסו כלוב עכבר אחד לארון הבטיחות הביולוגית, הסירו את כיסוי כלוב הפלסטיק והשאירו את מתלה המתכת במקומו.
- תפוס עכבר אחד בזנב והנח אותו על מתלה המתכת. החזק את העכבר בזנב ביד אחת והשתמש באגודל ובאצבעות האמצעיות של יד אחרת כדי לרסן את החיה על ידי אחיזת העור מעל הכתפיים. בדרך זו, הרגליים הקדמיות נמתחות הצידה, מה שימנע מהרגליים הקדמיות לדחוף את המחט החוצה. הרחיבו בעדינות את ראש החיה לאחור והחזיקו את הראש במקומו ביד אחת.
הערה: תרגל טיפול בעכבר עד שהנסיין יקבל ביטחון מלא לפני שתמשיך לניסוי.
- הניחו את מחט הגבאג' על גבי הלשון בתוך הפה. מתקדמים בעדינות לאורך החיך העליון עד שהמחט מגיעה לוושט. מעבירים את המחט בצורה חלקה בתנועה אחת. אין לדחוף את המחט אם מורגשת התנגדות כלשהי. הוציאו את המחט ונסו שוב.
- לאחר שהמחט ממוקמת כראוי ומאומתת, לאט לאט לנהל את החומר על ידי דחיפת המזרק מחובר למחט. אין לסובב את המחט או לדחוף את המחט קדימה, מה שעלול לקרוע את הוושט. לאחר המינון, משוך בעדינות את המחט החוצה.
- החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו. עקוב אחר בעל החיים במשך 5-10 דקות על ידי חיפוש סימנים של נשימה מאומצת או מצוקה. עקוב אחר העכברים שוב בין 12-24 שעות לאחר FMT.
